一、背景与目的 三阴性乳腺癌(Triple-negative Breast Cancer,TNBC)是指雌激素受体(Estrogen receptor,ER)、孕激素受体(Progesterone receptor,PR)和人类表皮生长因子受体 2(Human epidermal growth factor receptor 2,HER-2)均无表达的一类乳腺癌,是所有乳腺癌类型中恶性程度最高、预后最差的亚型。TNBC对内分泌治疗和抗HER2治疗多无效,且传统化疗治疗TNBC效果并不理想,因此现阶段探索针对TNBC的新兴疗法是乳腺癌研究的重点和难点。大多数TNBC都存在p53突变,意味着细胞G1期检查点失活,使细胞更依赖于G2/M期检查点来监控DNA损伤。研究表明,WEE1激酶和ATR激酶在G2/M期检查点和DNA损伤反应(DNAdamge response,DDR)中发挥着重要作用。本研究旨在探究WEE1抑制剂AZD1775联合ATR抑制剂AZD6738在TNBC中的抗肿瘤活性。通过体内外模型证实AZD1775和AZD6738的协同抗TNBC作用,并通过免疫印迹、免疫荧光和裸鼠皮下移植瘤模型等手段阐明AZD1775和AZD6738协同致死性的分子机制。从而为临床治疗TNBC提供新的手段。二、材料与方法1.探究AZD1775对TNBC细胞的影响用AZD1775处理7种TNBC细胞系,CCK8法检测TNBC细胞对AZD1775的敏感性。Western blot 检测 AZD1775 处理 TNBC 细胞 MDA-231 和 Hs578t后,对DDR相关蛋白、cleaved-caspase-3和pHH3表达的影响。2.比较ATR抑制剂、ATM抑制剂和DNA-PKcs抑制剂与AZD1775联用的效果用ATR抑制剂AZD6738、ATM抑制剂KU-60019或DNK-PKcs抑制剂NU7441和AZD1775联合运用处理MDA-231和Hs578t,CCK8法检测细胞活力比较三种联合方案抗增殖效果。3.检测AZD1775和AZD6738的协同作用AZD6738处理7种TNBC细胞系后,CCK8法检测TNBC细胞对AZD1775的敏感性。运用CCK8和细胞克隆形成实验在TNBC细胞中检测AZD1775和AZD6738单药或联合的抗增殖能力。利用CompuSyn软件计算上述实验中AZD1775和AZD6738的联合指数(Combination Index,CI)。流式技术检测AZD1775和AZD6738单药或联合对细胞凋亡的影响。4.比较 AZD1775 和 AZD6738 在 MDA-231、Hs578t、MCF7 和 MCF10A 中的联合效果 两种浓度比(1:5或5:1)的AZD1775和AZD6738联合处理MDA-231、Hs578t、MCF7和MCF10A,CCK8法检测细胞活力后,运用CompuSyn软件计算在各个细胞中AZD1775和AZD6738的CI值。AZD1775和AZD6738单药或联合处理MDA-231、Hs578t、MCF7和MCF10A后,流式技术检测细胞周期的改变。5.检测AZD1775与AZD6738联合对细胞DNA损伤和复制压力的影响AZD1775 和 AZD6738 单药或联合处理 MDA-231 和 Hs578t 后,Western Blot检测DDR相关蛋白、cleaved-caspase-3和pHH3的表达情况;流式技术检测γH2AX表达的变化;免疫荧光检测γH2AX、pRPA32(S4/S8)、RAD51的表达情况。6.分析AZD1775与AZD6738联合对细胞有丝分裂的影响AZD1775和AZD6738单药或联合处理MDA-231和Hs578t后,流式技术检测单个细胞的γ H2AX和pHH3表达情况。免疫荧光检测pHH3和α-tubulin的表达变化并观察有丝分裂和细胞核的形态。7.探讨CDKs激酶对AZD1775与AZD6738联合效应的作用CDK1/2 抑制剂 Roscovitine 或 CDK4/6 抑制剂 Palbociclib 预先处理 MDA-231和Hs578t后,再用AZD1775和AZD6738联合处理细胞,CCK8法检测增殖情况,免疫荧光检测γH2AX和RAD51的表达变化。Roscovitine或Palbociclib预先处理MDA-231和Hs578t后,用两种浓度比(1:5或5:1)的AZD1775和AZD6738联合处理细胞,CCK8法检测细胞活力后,运用CompuSyn软件计算在预处理前后AZD1775和AZD6738的CI值。8.明确AZD1775和AZD6738与顺铂联用的效果AZD1775和AZD6738单药或联合与顺铂共同处理MDA-231和Hs578t,CCK8法检测增殖,CompuSyn软件计算顺铂与AZD1775或AZD6738或两者联用时的CI值。Western Blot和免疫荧光检测药物处理后细胞γH2AX、RAD51和pHH3的表达变化。9.探讨BRCA1缺陷对AZD1775和AZD6738作用效果的影响构建BRCA1小干扰和慢病毒突变BRCA1表达载体,感染MDA-231细胞后,用AZD1775、AZD6738、两种抑制剂和顺铂、两种抑制剂和PARP抑制剂Veliparib联合处理细胞,CCK8法检测细胞活力。10.探究AZD1775联合AZD6738的体内抗TNBC疗效用MDA-231细胞构建裸鼠皮下移植瘤模型,成瘤后将裸鼠随机分为对照组、接受AZD1775治疗组,接受AZD6738治疗组,同时接受两种抑制剂治疗组,记录肿瘤体积和裸鼠体重变化。治疗结束后取肿瘤组织,免疫荧光检测γH2AX、pRPA32(S4/S8)和 pHH3 的表达变化,Western Blot 检测 pCHK1和pHH3的表达情况,TUNEL法检测细胞凋亡的情况。三、结果1.CCK8实验发现TNBC细胞对AZD1775高度敏感,AZD1775在6种TNBC细胞系中的IC50值小于1 nM。Western Blot检测发现AZD1775能上调DDR相关蛋白、凋亡蛋白cleaved-caspase-3和有丝分裂标记物pHH3的表达,并呈时间和浓度依赖性。2.CCK8结果显示低剂量的ATR抑制剂AZD6738能明显地增强AZD1775对TNBC细胞活力的抑制作用,而高剂量的ATM抑制剂和DNA-PKcs抑制剂对AZD1775的增敏效果仍不显著。3.细胞克隆实验和CCK8实验发现AZD6738能够增强AZD1775抗增殖作用,且两者的CI值多小于1,协同作用显著。流式技术检测到对比于AZD1775和AZD6738单药,两药联合显著提高细胞凋亡率。4.在两种浓度比模型中,AZD1775和AZD6738的CI值在MDA-231和Hs578t中均小于1,但在MCF7和MCF10A中多大于1。流式技术检测到AZD1775和AZD6738联合作用在MDA-231和Hs578t中引起轻微的S期阻滞,而在MCF7和MCF10A中引起明显的G1期阻滞。5.Western Blot的结果显示AZD6738抑制AZD1775诱导的pCHK1的激活,增强γH2AX、cleaved-caspase-3和pHH3的表达。免疫荧光发现对比AZD6738和AZD1775单药,两者联合显著上调γH2AX的表达,引起全核强阳性表达,并上调复制压力标记物pRPA32(S4/S8)的水平,但对RAD51的影响不大。6.流式技术检测到AZD6738和AZD1775的联合处理MDA-231和Hs578t细胞能同时上调单个细胞γH2AX和pHH3的表达水平。免疫荧光结果发现,AZD6738和AZD1775联合显著升高了 pHH3的水平,同时诱导不正常的有丝分裂和细胞核的多核化和微核化表型。7.CCK8法和免疫荧光实验发现,Roscovitine和Palbociclib预处理MDA-231和Hs578t后,降低了 AZD1775和AZD6738的抗增殖效应,上调了两药的CI值,减少了两药联合诱导的γH2AX全核阳性细胞数。8.对比AZD1775或AZD6738单药与顺铂联合,两药联合顺铂增强顺铂的抗TNBC疗效更为显著,3药联合的CI值小于1。Western Blot和免疫荧光结果发现AZD6738和AZD1775能抑制顺铂引起的RAD51表达上调,升高γH2AX的水平,促进有丝分裂的发生。9.在MDA-231中,BRCA1干扰后能够增强AZD6738的抗TNBC能力。BRCA1的干扰和突变BRCA1的表达能够增强TNBC细胞对顺铂和Veliparib的敏感性,并进一步增强AZD1775和AZD6738两药与顺铂或Veliparib联合的疗效。10.对比AZD1775和AZD6738的单药治疗,两者联合更显著地抑制了裸鼠移植瘤的生长,且两药联合对裸鼠体重影响不大。Western blot和免疫荧光实验发现,在肿瘤组织中,AZD6738也抑制了 AZD1775诱导pCHK1的升高,两者联用增强了 DNA损伤和复制压力,促进有丝分裂的发生。四、结论与意义1.AZD1775能显著抑制TNBC细胞增殖,引起细胞DNA损伤和激活DDR。在体内外模型中均发现AZD6738能明显地增强AZD1775的抗TNBC效应。本文首次揭示了 ATR抑制剂和WEE1抑制剂在抗肿瘤中的协同作用。2.AZD6738协同AZD1775的作用机制是:AZD6738抑制AZD1775激活的DDR,加重DNA损伤和复制压力,并诱导有丝分裂灾变的发生,促进细胞的凋亡和死亡,且上述过程依赖于CDKs激酶的持续激活。本文首次阐述了WEE1抑制与ATR抑制协同致死性的分子机制。3.AZD6738和AZD1775单药或两者与顺铂联用能够增强TNBC对顺铂的敏感性。BRCA1缺陷能够增强AZD6738抗TNBC作用,以及进一步增加AZD1775和AZD6738两者与顺铂联用时的疗效,为TNBC的临床治疗提供新策略。