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目的观察“双固一通”针法对去卵巢绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis, PMO)模型大鼠调节骨吸收平衡的相关细胞因子系统——护骨素(osteoprotegerin, OPG)/核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)/核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB, RANK)系统的影响,进一步探讨“双固一通”针法治疗本病的作用机制,为针灸治疗PMO提供新的思路和方法,为临床预防和治疗PMO提供实验依据。方法依随机原则将50只SD大鼠分为对照组、模型组、常规取穴针刺组(简称常规组)、“双固一通”针刺组(简称双固一通组)和中成药治疗组(简称中成药组),每组10只。模型组、常规组、双固一通组和中成药组切除双侧卵巢后常规饲养,造成实验性PMO动物模型。90天后常规组、双固一通组采用电针治疗,中成药组早晚予仙灵骨葆胶囊灌胃治疗(早晚以0.4g/次灌胃,药液量以生理盐水溶解,调整至3m1),对照组、模型组早晚予生理盐水3m1灌胃,用药期间常规饲养。疗程均为8周。电针治疗(采用四川恒明科技开发有限公司生产HM-6805型经穴治疗仪,疏密波8～80Hz,疏密波转换14次/分钟,电压1.5V,强度1mA左右,通电15min),每天1次,每次15分钟,留针10分钟,连续治疗6天后休息1天,共治疗8周。常规组取穴：脾俞、胃俞、肾俞,气海俞,均为双侧；双固一通组取关元、后三里(双)、肾俞(双)、膈俞(双)、大杼(双)。用全自动生化仪测定血清钙(calcium, Ca)、磷(phosphorus,P)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)和尿钙、尿磷、尿肌酐；用放射免疫法测定血骨钙素(Osteocalcin, BGP);用酶联免疫法(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay, ELISA)测定尿脱氧吡啶啉(Deoxypyridinoline, DPD)的含量；用化学发光免疫分析法检测雌二醇(estradiol,E2); ELISA法检测白细胞介素(interletukin, IL)-6、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)、OPG、RANKL、RANK;双能x线骨密度仪检测骨密度(bone mass density, BMD); HE染色观察大鼠骨组织形态学的变化；反转录聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, RT-PCR)法检测M-CSF、OPG、RANKL-mRNA表达及OPG/RANKL。大鼠因造模手术、麻醉、灌胃死亡,取材时各组大鼠数量如下：对照组8只,模型组6只,中成药组6只,常规组6只,双固一通组7只。结果1模型组血Ca值明显降低、血P值明显升高、血ALP值明显升高、BGP明显升高,有非常显著性差异(P<0.01)。与模型组比较,双固一通组和中成药组血Ca明显升高、血P明显降低、血ALP明显降低,BGP明显升高有非常显著性差异(P<0.01)；双固一通组优于常规组(P<0.01)。模型组尿Ca/Cr、P/Cr比值明显升高,有非常显著性差异(P<0.01)；与模型组比较,各组Ca/Cr、P/Cr比值均降低,常规组有非常显著性差异(P<0.01),双固一通组Ca/Cr有非常显著性差异(P<0.01),P/Cr有显著性差异(P<0.05)；双固一通组与中成药组和常规组比,无显著性差异(P>0.05)。模型组尿DPD明显升高,有显著性差异(P<0.05)。与模型组比较,双固一通组尿DPD含量明显降低,有非常显著性差异(P<0.01)；双固一通组与中成药组和常规组比,无显著性差异(P>0.05)。模型组血Ca明显降低、而血P、ALP值明显升高、血BGP明显升高(P<0.01)；尿Ca/Cr、P/Cr明显升高(P<0.01),尿DPD明显升高(P<0.05)。说明去卵巢骨质疏松症模型大鼠呈现高骨转化率,骨吸收增加,伴随骨形成代偿性增加,骨量减少,预示骨密度降低,与临床常见的PMO女性的骨高转换率极相似,提示造模成功。而“双固一通”针灸治疗后,BGP显著升高,提示成骨细胞(OB)活性增强,骨形成增加。双固一通组、中成药组均可升高血钙,降低血磷,降低尿Ca/Cr、尿P/Cr、DPD；常规组可升高血钙,降低尿Ca/Cr、尿P/Cr、DPD,对于血P无明显的降低作用。说明中医药治疗可以调节Ca、P代谢,促进骨形成,减缓骨吸收。2模型组腰椎BMD明显降低,有非常显著性差异(P<0.01)。与模型组比较,各治疗组腰椎BMD均明显升高,有非常显著性差异(P<0.01)。与双固一通组比较,有显著性差异(P<0.05)。与对照组比较,模型组股骨BMD明显降低,有非常显著性差异(P<0.01)。与模型组比较,各治疗组股骨BMD均明显升高,有显著性差异(P<0.05)；与双固一通组比较,各组无显著性差异(P>0.05)。3光镜观察结果显示：模型组骨小梁稀疏、细、中断点多、间距宽,部分区域出现较大的空白区域。常规组、中成药组、双固一通组的骨小梁增多、增粗、间隙变窄,中断点减少,三组间的区别不明显。双固一通的骨小梁排列密集,相互之间的连接明显增多,宽度增宽,体积增大,间隙变窄。4模型组血清IL-6明显升高,E2明显降低,有非常显著性差异(P<0.01)。与模型组比较,各治疗组血清IL-6均降低,E2明显升高,有非常显著性差异(P<0.01)。与中成药组比较,双固一通组和常规组血E2无显著性差异(P>0.05)。双固一通组优于常规组和中成药组(P<0.01)。在本实验中模型组E2水平降低,IL-6含量增高,与既往的研究结果一致。“双固一通”针灸治疗后,大鼠血E2显著升高、IL-6显著下降(P<0.05),双固一通组优于常规组和中成药组。表明“双固一通”针法治疗能够升高雌激素,抑制IL-6分泌,抑制OC的活性,促进骨的形成。5模型组血M-CSF明显升高、OPG明显降低、RANKL明显降低、RANK值明显降低,有非常显著性差异(P<0.01)；与模型组比较,双固一通组、常规组和中成药组M-CSF明显降低、OPG值明显升高、RANK明显升高,有非常显著性差异(P<0.01)；与模型组比较,中成药组血清RANKL升高,常规组血清RANKL有降低趋势,但均无显著性差异。双固一通组优于常规组和中成药组。说明针刺可以通过提高血OPG、RANKL、RANK的含量,降低M-CSF,从而抑制破骨细胞(osteoclast,OC)的骨吸收来减少骨量的丢失,且“双固一通,,针法优于其它方法。6模型组骨M-CSFmRNA表达较对照组明显升高,有非常显著性差异(P<0.01)。与模型组比较,各治疗组M-CSFmRNA表达均降低,有非常显著性差异(P<0.01)。与双固一通组比较,常规组M-CSFmRNA表达升高,有显著性差异(P<0.05),中成药组有非常显著性差异(P<0.01)。中成药组、常规组、双固一通组均有效,但双固一通组效最好。模型组骨OPGmRNA表达较对照组明显降低,有非常显著性差异(P<0.01)。与模型组比较,各治疗组OPGmRNA表达均升高,有非常显著性差异(P<0.01)。与中成药组和常规组比较,双固一通组有非常显著性差异(P<0.01),与对照组比较,无显著性差异(P>0.05)。中成药组、常规组、双固一通组均有效,但双固一通组效最好。模型组骨RANKLmRNA表达较对照组明显降低,有非常显著性差异(P<0.01)。与模型组比较,双固一通组骨RANKLmRNA表达升高,有非常显著性差异(P<0.01),中成药组和常规组RANKLmRNA表达与模型组比无显著性差异(P>0.05)。双固一通组与中成药组比有显著性差异(P<0.05)。双固一通组有效,中成药组和常规组均无效。模型组骨OPG/RANKL比值较对照组显著降低,有显著性差异(P<0.05)。与模型组比,双固一通组骨OPG/RANKL比值升高,有非常显著性差异(P<0.01),中成药组与模型组比有显著性差异(P<0.05),常规组与模型组比无显著性差异(P>0.05)。中成药组与双固一通组均有效,但双固一通组效更好。本研究结果表明：模型组骨M-CSFmRNA表达明显升高(P<0.01),提示OC生成增加；各治疗组M-CSFmRNA表达均降低(P<0.01),表明中医药治疗尤其是“双固一通”针法可以抑制OC数量,或降低OC活性,减缓骨吸收。模型组骨OPG、RANKLmRNA表达显著降低(P<0.01),提示OPG蛋白表达降低,破骨吸收增加；RANKL蛋白表达降低,OPG与RANKL结合有一定程度的阻滞OC生成的作用,而综合作用仍表现为骨吸收的增加。OPG/RANKL比值能反映成骨细胞(osteoblast, OB)的形成,比值越大,OB介导的能力越强；englixibaoweiia促进骨吸收,限制骨矿化的速度。模型组骨OPG/RANKL比值表达较对照组明显降低,提示骨形成降低。双固一通组骨OPG、RANKLmRNA表达明显升高(P<0.01)、RANKLmRNA表达降低(P<0.01),OPG/RANKL比值明显升高(P<0.01),提示“双固一通”针法可能通过促进OPG蛋白表达,提高OB活性,通过与RANK竞争和RANKL的结合,阻止OC的生成,阻止骨吸收。结论通过本课题的研究,我们认为：“双固一通”针法对OPG/RANKL /RANK的调节是多环节、多途径的：1“双固一通”针灸治疗后,BGP显著升高,提示成骨细胞活性增强,骨形成增加；血钙升高,血磷降低,尿Ca/Cr、尿P/Cr、DPD降低,提示“双固一通”针灸治疗可以通过增加胃肠吸收功能,促进对钙、磷等各种营养物质的吸收和利用,调节Ca、P代谢,降低尿Ⅰ型胶原分解产物DPD浓度,提高BGP浓度,从而抑制骨吸收、促进骨形成,最终使骨矿含量增加,维持甚至提高骨密度。2“双固一通”针灸治疗能通过提高去卵巢骨质疏松症模型大鼠E2的水平,减少IL-6含量,加强雌激素对IL-6的抑制作用,减少OC的前体细胞形成,抑制骨吸收,表现为BMD的升高、模型大鼠骨组织形态结构的改善。3“双固一通”针灸治疗能升高去卵巢骨质疏松症模型大鼠血清OPG、RANKL、RANK含量和降低M-CSF水平,以抑制OC的活性而减少骨吸收,减少骨量的丢失。4“双固一通”针灸治疗能升高去卵巢骨质疏松症模型大鼠血清OPG、RANKL、RANK含量和降低M-CSF,以抑制OC的活性而减少骨吸收,减少骨量的丢失；“双固一通”针灸治疗能通过降低去卵巢骨质疏松症模型大鼠骨M-CSFmRNA表达来抑制OC数量,或降低OC活性,减缓骨吸收；通过升高骨OPGmRNA表达,升高RANKLmRNA的表达,提高OB活性,通过与RANK竞争和RANKL的结合,阻止OC的生成,阻止骨吸收；通过升高OPG/RANKL比值,调节OPG/RANKL/RANK,能抑制OC活性,拮抗骨吸收。