作为全球性公共卫生问题,肥胖对人类健康的威胁日趋严重。世界卫生组织规定,肥胖指标通常由BMI(体重指数)量化,BMI>30kg/m2相当于肥胖[1],肥胖的主要表征是脂肪组织的过度堆积及病理性扩张。除了能储存能量外,脂肪组织还是活跃的分泌器官,其分泌的炎症介质及信号因子在机体的炎症介导和免疫调控中发挥了重要作用。肥胖状态下脂肪组织分泌功能异常,引起脂肪因子分泌增多及巨噬细胞浸润,使机体处于固有免疫异常及系统性低度炎症状态,巨噬细胞表型及功能发生改变,容易诱发机体肥胖性胰岛素抵抗状态,增加心血管糖尿病等多种系统性全身性疾病风险[2]。根据世界卫生组织2008年公布数据显示,全球每年至少有280万人死于肥胖及其相关全身性系统性疾病如心脑血管疾病,糖尿病,肿瘤等。牙周炎作为一种由牙菌斑微生物引起的慢性感染性疾病,其发生发展不仅受到机体自身的免疫性炎症反应调控,更可能通过释放促炎因子进入血液循环等方式,对机体的免疫功能产生影响。而作为肥胖与牙周炎的共同病理基础,免疫异常反应也可能是两者相互影响的重要机制,目前众多研究提示,肥胖导致的脂肪组织病理学改变使脂肪因子构成改变,炎性细胞因子分泌增多,可能影响机体对牙周致病菌感染的固有免疫反应。已有研究表明,牙周炎患者的BMI指数与其牙周附着丧失程度正相关。多项研究提示,巨噬细胞表型及功能改变与肥胖引起的固有免疫异常及系统性慢性低度炎症状态相互影响。巨噬细胞作为一种重要的固有免疫细胞,具有可塑性及多能性,可根据微环境的不同分化为M1,M2等不同表型。在机体促炎和抗炎的免疫平衡的调控中起重要作用。M1型又称诱导型巨噬细胞,为促炎症型,主要分泌促炎性细胞因子IL-6, IL-1β, TNF-α。M2又称条件活化型巨噬细胞,为抗炎症型,主要分泌对炎症有调节作用的IL-10等细胞因子。M1、M2型的比例变化在一定程度上反应了机体的免疫状态,在脂肪组织炎症等免疫病理中已成为经典的范式。脾脏是巨噬细胞在体内的主要定居场所之一,含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞,是机体细胞免疫和体液免疫的中心。脾巨噬细胞是调节机体免疫反应的重要细胞之一,在维持对自体抗原的免疫耐受,抗原提呈等免疫机制中起重要作用。目前,牙周炎及肥胖与机体免疫状态的具体关联机制仍然不确定,但研究资料显示,机体巨噬细胞表型功能的改变与牙周炎及肥胖相关固有免疫反应异常及系统性慢性低度炎症状态相互影响,并能引起肥胖性胰岛素抵抗。而机体的慢性炎症状态及固有免疫反应异常是肥胖相关疾病如糖尿病,高血压,动脉粥样硬化等的共同潜在病理基础。因此,巨噬细胞及炎症介质可能是联系牙周炎与肥胖的枢纽。本实验通过建立牙周炎复合肥胖小鼠模型,检测各组小鼠模型脾脏巨噬细胞表型极化及相关炎性细胞因子mRNA相对表达水平的差异,及血清TNF-a, IL-1β,IL-10的表达差异,探讨牙周炎复合肥胖状态与脾脏巨噬细胞乃至机体系统性免疫状态的关系。第一章食诱导型肥胖伴牙周炎的小鼠模型建立目的建立肥胖复合牙周炎小鼠模型,为下一步研究牙周炎复合肥胖对脾巨噬细胞的影响奠定基础。方法1取44.只小鼠随机分为高脂饲料组(high fat diet, HF)和低脂饲料组两组(low fat diet, LF)(HF组22只、LF组22只),以标准60 kcal%高脂饲料和10 kcal%低脂饲料喂养16周,诱导肥胖。2诱导时间结束后,将每个饲料组分为真性结扎组(P组)和假性结扎组(C组),P组采用丝线结扎法诱导实验性牙周炎,C组做对照处理。牙周结扎期为十天。得到肥胖复合牙周炎组(HFP)小鼠,对照组(LFC)小鼠,肥胖组(HFC)小鼠,牙周炎组(LFP)小鼠每组各11只。3取上颌骨进行HE染色以观察牙周组织病理学改变(n=3)。结果采用于高脂饲料喂养法可建立肥胖大鼠模型,建模时间约8周；牙周结扎以涂布牙龈卟啉单孢菌的丝线10天可以建立牙周炎小鼠模型；而于小鼠新生期予以高脂饲养并于牙周结扎以涂布牙龈卟啉单孢菌的丝线10天,可成功建立牙周炎复合肥胖的小鼠模型；本模型的成功建立为研究牙周炎与肥胖对小鼠脾脏巨噬细胞免疫功能的影响奠定模型基础。第二章牙周炎复合肥胖小鼠血清炎症因子浓度的检测目的研究各组小鼠血清相应炎症因子浓度变化差异,以探讨肥胖及牙周致病菌感染对脾脏及全身系统性免疫功能的影响.方法1 D1016周小鼠44只,随机分为高脂饲料组(HF)和低脂饲料组(LF)饲料诱导16周后,组内随机分为真性结扎组(P)、假性结扎组(C),进行实验性牙周炎诱导,牙周结扎期10天,得到肥胖复合牙周炎组(HFP)小鼠,对照组(LFC)小鼠,肥胖组(HFC)小鼠,牙周炎组(LFP)小鼠每组各11只2蛋白芯片法检测血清炎症因子：各组小鼠眼球取血,高速离心法沉淀分离血清,利用蛋白芯片法检测各组血清促炎型炎症因子TNF-α、IL-1β,抑炎性细胞因子IL-10反应差异(n=4-7),以观察肥胖状态下,牙周炎对全身免疫功能的影响。3应用软件spss20进行统计分析。先对各指标行正态性及方差齐性检验。两因素两水平数据比较采用析因设计,分析两种干预主效应及交互作用,计量资料比较采用单因素方差分析,LSD检验比较两组间差异,以双侧P<0.05为差异有统计学意义。结果对比各组血清炎症因子(IL-1β、TNF-α、IL-10)的反应差异(n=4～7),One-way ANOVA分析显示,16周时肥胖小鼠的IL-1β, IL-10, TNF-α浓度相对于对体重组正常显著上调(IL-1β:F=5.475,p<0.05 IL-10:F=11.557,p<0.05; TNF-α:F=17.76,p<0.01),16周时,在肥胖状态下,牙周炎小鼠的TNF-α, IL-10浓度相对于单纯肥胖小鼠受到显著抑制(TNF-α:F=6.60,p<0.01; IL-10: F=17.88,p<0.01);结论肥胖状态使小鼠脾IL-1β, IL-10, TNF-α血清浓度水平上升。肥胖状态下牙周致病菌感染使小鼠的TNF-α, IL-10浓度相对于单纯肥胖小鼠受到显著抑制,提示肥胖复合牙周炎状态的小鼠出现了一定程度的免疫耐受。第三章牙周炎复合肥胖小鼠脾脏巨噬细胞表型的检测目的研究肥胖状态下牙周炎小鼠脾脏巨噬细胞相对数量、表型比例及功能的影响,以探讨肥胖及牙周致病菌感染对全身系统性免疫功能的影响.方法1 D1016周小鼠44只,随机分为高脂饲料组(HF)和低脂饲料组(LF)饲料诱导16周后,组内随机分为真性结扎组(P)、假性结扎组(C),进行实验性牙周炎诱导,牙周结扎期10天,得到肥胖复合牙周炎组(HFP)小鼠,对照组(LFC)小鼠,肥胖组(HFC)小鼠,牙周炎组(LFP)小鼠每组各11只2处死小鼠后,在无菌环境中取出小鼠脾脏并分离脾脏单个核细胞,计数,应用流式细胞术(fluorescence activated cell sorting, FACS)检测单核巨噬细胞及其M1,M2表型的比例。3应用软件spss20进行统计分析。先对各指标行正态性及方差齐性检验。两因素两水平数据比较采用Two-way-anova析因设计,分析两种干预主效应及交互作用,计量资料比较采用单因素方差分析,LSD检验比较两组间差异,以双侧P<0.05为差异有统计学意义。结果M1型：与对照组LFC=[(11.47±6.5)%]及肥胖组HFP=[4.04±1.01)%](p=0.032<0.05)相比,肥胖复合牙周炎组HFP=[(5.22±2.33) %](p=0.031<0.05)的M1型巨噬细胞占脾成熟巨噬细胞比例下降。M2型巨噬细胞：肥胖复合牙周炎组.(HFP=33.38%±11.75%)>肥胖组(HFC=44.81%±18.12%)>对照组(LFC=22.01%±16.89%)>牙周炎组(LFP=23.24%+1 8.97%).与对照组相比,肥胖组M2巨噬细胞比例明显上升(LFC=22.01%±16.89%vs HFC=44.81%士18.12%,p<0.05).肥胖可使M2型巨噬细胞在脾巨噬细胞中的比例上升。结论：肥胖状态能通过上调对炎症有抑制作用的M2巨噬细胞表型极化比例,抑制巨噬细胞向促炎的M1型极化。牙周炎在肥胖状态基础上进一步抑制M1巨噬细胞比例。第四章肥胖状态下牙周炎对炎症因子mRNA转录水平的影响目的研究各组小鼠脾脏巨噬细胞分泌炎症因子功能的差异,观察血清相应炎症因子变化,以探讨肥胖及牙周致病菌感染对脾脏及全身系统性免疫功能的影响.方法1 D1016周小鼠44只,随机分为高脂饲料组(HF)和低脂饲料组(LF)饲料诱导16周后,组内随机分为真性结扎组(P)、假性结扎组(C),进行实验性牙周炎诱导,牙周结扎期10天,得到肥胖复合牙周炎组(HFP)小鼠,对照组(LFC)小鼠,肥胖组(HFC)小鼠,牙周炎组(LFP)小鼠每组各11只2无菌条件下处死小鼠,分离脾脏,液氮冻存后研磨裂解脾脏组织,实时荧光定量PCR法检测各组脾脏中M1型巨噬细胞相关炎型细胞因子TNF-α、IL-1β,M2型巨噬细胞相关细胞因子IL-10 mRNA相对表达水平的差异。3实时荧光定量PCR法检测各组脾脏中巨噬细胞相关促炎型细胞因子TNF-α、IL-1β,抑炎性细胞因子IL-10 mRNA相对表达水平的差异。4应用软件spss20进行统计分析。先对各指标行正态性及方差齐性检验。两因素两水平数据比较采用Two-way-anova析因设计,组间两两比较采用独立样本T检验,结果1实时荧光定量PCR法检测脾脏巨噬细胞相关细胞因子mRNA:与对照组相比,肥胖状态下M1型巨噬细胞炎症因子IL-1βmRNA表达水平下降(HFC=0.59±0.23,p<0.05)的同时IL-10mRNA (4.03±0.29,p<0.05)表达水平升高。肥胖复合牙周致病菌感染状态下M1型巨噬细胞炎症因子IL-1βmRNA表达水平下降(0.28±0.04,p<0.05)的同时IL-10mRNA (4.03±0.29,p<0.05)表达水平升高。与单纯牙周炎组(0.62±0.28,p<0.05)相比,肥胖复合牙周炎组IL-1βmRNA的表达水平下降(p<0.05), IL-10mRNA表达水平升高。全文结论：通过血清炎症因子水平检测实验,发现肥胖状态使机体炎症因子浓度升高,机体处于低度炎症状态；在肥胖状态下,进一步的牙周感染状态使血清促炎因子浓度下降,下调机体炎症水平,这可能与在肥胖机体已有低度炎症状态下,牙周感染的发生诱发了机体的免疫异常反应有关,即机体对持续10天的牙周致病菌感染产生了免疫耐受反应。通过流式细胞检测数发现,肥胖状态对小鼠脾巨噬细胞活化有一定抑制作用,且能通过上调对炎症有抑制作用的M2巨噬细胞表型极化比例,抑制促炎的M1型巨噬细胞极化比例。牙周炎在肥胖状态基础上进一步抑制M1巨噬细胞比例。通过PCR实验发现,肥胖状态下调M1型巨噬细胞炎症因子IL-1p的相对表达水平。上调牙周致病菌感染机体M2型巨噬细胞炎症因子IL-10的相对表达水平。肥胖状态下小鼠脾巨噬细胞向M2型极化增多,脾脏组织中对炎症有调节抑制作用的细胞因子IL-10 mRNA相对表达水平上升,脾巨噬细胞向M1向极化受到抑制,有促炎作用的细胞因子IL-1βmRNA相对表达水平下降。而牙周炎对肥胖机体的血清促炎因子TNF-α, IL-1β浓度升高有抑制作用,在脾脏组织则表现为进一步抑制脾巨噬细胞向M1型极化,即肥胖机体的慢性低度炎症状态使脾巨噬细胞产生向对炎症有调节作用的M2型极化增多,对炎症有促进作用的M1型极化减少,对机体的炎症水平产生负向调节作用。