背景:维护小肠上皮的完整依赖于上皮细胞的增殖,生长和凋亡之间的平衡。凋亡抑制蛋白XIAP(X-link inhibitor of apoptosis protein)在小肠细胞上皮的凋亡中有重要作用,是抑制细胞凋亡的关键蛋白。但RNA结合蛋白HuR能与含AREs(AU richelement)的目的基因的mRNA结合,能稳定目的基因的mRNA,并促进目的基因的翻译,对目的基因进行转录后调节。在对XIAP mRNA的研究中发现,XIAP mRNA具有AREs,可能是HuR的识别片段,HuR可能能通过与XIAP mRNA的AREs结合而对XIAP的表达进行转录后调节。多胺是一类广泛存在于生物体各种组织细胞中的脂肪胺类,对小肠上皮细胞生长、增殖和迁移,修复黏膜、维持黏膜完整有重要作用。多胺耗竭能提高小肠上皮细胞抗凋亡能力,小肠上皮细胞的XIAP表达增高,促进HuR从细胞核内向细胞浆内迁移,细胞浆内的HuR表达增高。但其确却的作用机制仍不明确。甘草的有效单体成分甘草酸具有保护上皮,维护上皮完整的作用,在此前的研究中发现甘草酸能促进一些HuR的目的基因如Bcl-2,p53的表达,但其具体的作用机制不明确。假说:RNA结合蛋白HuR能与XIAP mRNA结合并调节其表达,在多胺耗竭后,HuR从细胞核内向细胞浆内迁移,细胞浆内增高的HuR可与XIAP mRNA结合,稳定XIAP mRNA,使其衰减减慢,从而导致XIAP表达增高,多胺耗竭是通过增高的HuR对XIAP进行转录后调节,促进XIAP的表达,从而提高小肠上皮细胞的抗凋亡能力,甘草酸亦可能通过此途径对RNA结合蛋白及其目的基因进行转录后调节。本课题的研究,集中在HuR对XIAP表达的转录后调节作用,研究多胺耗竭是否能通过增加HuR在细胞浆中的含量,增加HuR与XIAP mRNA的结合,对XIAP进行转录后调节,从而抗细胞凋亡,明确HuR对XIAP转录后调节作用,多胺耗竭对小肠上皮细胞抗凋亡作用机制。在此同时,将该思路和方法引入中药作用的分子机制研究。将对有保护上皮作用的甘草有效成分甘草酸对RNA结合蛋白的表达及HuR的目的基因表达影响进行研究,以探讨甘草酸是否能通过RNA结合蛋白调节目的基因的表达。通过此研究,明确RNA结合蛋白HuR对XIAP的转录后的调节作用和机制,阐明多胺耗竭通过HuR对XIAP mRNA的转录后调节,并明确其抗细胞凋亡的作用和机制。并将该思路和方法引进中药有效成分的作用机制研究中,初步探讨甘草酸在此途径中的作用。同时为建立中药成分的分子和细胞作用机制研究技术平台提供基础。方法:1.HuR对XIAP转录后调节作用1.1 HuR与XIAP mRNA的相互作用:分别用pull down和mRNP IP分析HuR与XIAP的mRNA的体外和体内结合1.2 HuR过表达对XIAP转录后调节1.2.1 HuR过表达细胞模型:用能表达HuR的腺病毒载体感染大鼠小肠上皮细胞IEC-6过表达HuR,后用western blot检测HuR的表达量。1.2.2 HuR过表达对XIAP mRNA稳定性的影响:HuR过表达后用actinomycin D终止细胞RNA的合成,在RNA合成终止后的相应时间点提取RNA,用RT-PCR和RT-Q-PCR检测XIAP mRNA的含量。1.2.3 HuR过表达对XIAP mRNA翻译的影响:首先针对Pubmed上的基因库中查出大鼠XIAP的完整基因序列,用带EooR1和Kpn1酶切位点的引物用PCR扩增完整的XIAP CR(去除起始密码子atg)和XIAP 3’UTR,将PCR扩增产物,pEGFP C1,pEGFP N1进行EeoR1和Kpn1双酶切,后用T4 DNA接酶连接酶切片段和质粒,将XIAP CR插入pEGFP N1,置于报告基因EGFP之前(pEGFP N1-XIAP CR);将XIAP 3’UTR插入pEGFP C1,置于报告基因EGFP之后(pEGFP N1-XIAP 3’UTR)。后转化感受态细胞DH5α,通过卡那霉素抗性筛选挑取阳性克隆,抽提质粒,后进行测序法鉴定。对细胞进行HuR过表达处理,再转染相应的质粒,后观察HuR过表达对质粒报告基因表达的影响,由此观察HuR通过XIAPmRNA对XIAP翻译表达的作用。1.2.4 HuR过表达对XIAP表达的影响:HuR过表达后,用western blot检测XIAP表达量。1.3 HuR沉默对XIAP转录后调节1.3.1 HuR表达沉默的细胞模型:用siHuR转染IEC-6,建立HuR沉默的细胞模型;1.3.2 HuR表达沉默对XIAP转录后调节:HuR沉默后,如前检测XIAPmRNA的稳定性和XIAP的表达;转染pEGFP N1-XIAP CR或pEGFP N1-XIAP 3’UTR,观察HuR沉默通过XIAP mRNA对XIAP翻译表达的作用。2.多胺对XIAP转录后调节2.1多胺耗竭细胞模型建立:用多胺合成关键酶ODC(鸟氨酸脱羧酶)的抑制剂DFMO建立多胺耗竭模型。2.2多胺耗竭对XIAP转录后调节:DFMO处理后,如前检测XIAP mRNA与HuR的结合,XIAP mRNA的稳定性和XIAP的表达,转染pEGFP N1-XIAP CR或pEGFP N1-XIAP 3’UTR,观察DFMO通过XIAP mRNA对XIAP翻译表达的作用。2.3 HuR沉默对DFMO对XIAP转录后调节作用的影响:DFMO作用后,用RNA干扰将HuR沉默,后观察XIAP mRNA稳定性,XIAP的表达,以及对XIAP翻译作用的影响。3.DFMO通过HuR和XIAP对细胞抗凋亡能力的影响:在DFMO作用后,沉默XIAP或HuR的表达,用TNF-α/CHX诱导凋亡,后观察细胞凋亡数量,ANNEXIN V染色,观察caspase 3含量。4.甘草酸对RNA结合蛋白对目的基因转录后调节的影响4.1甘草酸对RNA结合蛋白的影响:在甘草酸作用48h后,检测细胞核内及细胞浆RNA结合蛋白HuR及TIAR的表达。4.2甘草酸对HuR目的基因的表达影响:甘草酸作用后检测ATF-2和XIAP的表达影响以及HuR与ATF-2内源性结合。结果:1.HuR与XIAP mRNA的相互作用:发现HuR不但能与XIAP mRNA 3’UTR结合,还能与XIAP CR结合。2.HuR对XIAP转录后调节作用2.1 HuR过表达对XIAP转录后翻译的调节:2.1.1 HuR过表达对XIAP mRNA稳定性及蛋白质表达的影响:发现HuR过表达后的半衰期延长,稳定性增加。HuR过表达能促进XIAP蛋白质的表达,在20-200pfu/cell浓度范围内,其作用呈比例增长。同时用荧光染色发现,XIAP的分布主要在细胞浆内,HuR过表达后,其荧光量明显增加。2.1.2 HuR过表达通过XIAP mRNA对XIAP的翻译表达的影响:在HuR过表达后,转染XIAP CR或XIAP 3’UTR的质粒,与对照组比较,HuR过表达后能增加其报告基因EGFP的表达,说明HuR能通过XIAP CR和XIAP 3’UTR增加XIAP的翻译。2.2 HuR沉默对XIAP转录后翻译的调节2.2.1 HuR沉默对XIAP mRNA稳定性和XIAP蛋白表达的影响:HuR沉默后能加速XIAPmRNA的降解,缩短其半衰期,降低XIAP蛋白表达。2.2.2 HuR沉默通过XIAP mRNA对XIAP的翻译表达的影响:在HuR沉默后,转染XIAPCR或XIAP 3’UTR的质粒,与对照组比较,HuR沉默后能降低其报告基因EGFP C1的表达,说明HuR沉默能通过XIAP CR和XIAP 3’UTR降低XIAP的翻译表达。3.多胺通过HuR对XIAP转录后翻译调节作用3.1多胺耗竭对HuR与XIAPmRNA结合的影响:在DFMO处理后,两者的结合增强,说明多胺耗竭能使XIAP mRNA与HuR的结合增强。3.2多胺耗竭对XIAP mRNA转录后调节3.2.1多胺耗竭对对XIAP mRNA稳定性和翻译的影响:在DFMO处理后,与对照组比较,XIAP mRNA的稳定性明显增高,XIAP的表达增高。说明DFMO能增高HuR与XIAPmRNA的结合,从而增高XIAP mRNA的稳定性,促进XIAP蛋白质的表达。3.2.2多胺耗竭通过XIAP mRNA对XIAP翻译表达的影响:在DFMO处理后,对于不含XIAP CR的质粒,其报告基因EGFP的表达无明显的作用,对于含XIAP CR的质粒,DFMO后能增高其报告基因EGFP N1的表达;对于XIAP 3’UTR,DFMO处理后能增高其报告基因EGFP C1的表达,说明DFMO能通过XIAP CR和XIAP 3’UTR增加XIAP的翻译表达。3.2.3 HuR沉默逆转DFMO对XIAP转录后翻译的上调作用:在HuR沉默后,DFMO对XIAPmRNA稳定性的增高,XIAP的表达增高以及XIAP翻译的增高作用完全被逆转,而与对照组相接近。4.DFMO通过HuR增高XIAP表达,从而提高细胞抗凋亡能力:4.1在DFMO作用后,并用TNF-α/CHX诱导凋亡,发现在DFMO作用后,细胞抗凋亡能力大为提高,TNF-α/CHX的诱导后,与对照组比较,细胞凋亡明显减少,procaspase 3的剪切明显减少。4.2在DFMO作用后,沉默XIAP或HuR的表达,用TNF-α/CHX诱导凋亡,发现在沉默HuR后,细胞抗凋亡能力明显下降,凋亡细胞数量明显增加,procaspase 3的剪切明显增加,caspase 3含量明显增高。表明HuR沉默能阻断DFMO的抗凋亡作用。在沉默XIAP后出现同样的情况,XIAP沉默同样能阻断DFMO的抗凋亡作用。该结果表明,DVMO的抗凋亡作用是通过HuR增高的XIAP产生作用的。5.甘草酸对RNA结合蛋白对目的基因转录后调节的影响5.1甘草酸对RNA结合蛋白的影响:在甘草酸作用48h后,能促进HuR从细胞核内向细胞浆转移,增加在细胞浆内的含量,对TIAR没有明显的影响。5.2甘草酸对HuR目的基因的表达影响:甘草酸能增加ATF-2的表达,但对XIAP的表达无明显影响。5.3甘草酸对HuR与目的基因的mRNA内源性结合的影响:在甘草酸作用48h后,ATF-2与HuR的内源性结合明显增加。结论RNA结合蛋白HuR能与XIAP mRNA结合并调节其表达,稳定XIAP mRNA,促进XIAP的翻译表达,对XIAP进行转录后表达调节。在多胺耗竭后,HuR从细胞核内向细胞浆内转移,细胞浆内增高的HuR可与XIAP mRNA结合,稳定XIAP mRNA,使其衰减减慢,从而导致XIAP的翻译表达增高,DFMO通过增高细胞激浆内的HuR含量,促进XIAP的表达,从而提高细胞的抗调亡能力。甘草酸能促进HuR从细胞核内向细胞浆内转移,同时增高ATF-2的表达。