疟原虫抗药性的产生和迅速扩散使全球疟疾防治面临严重困难。特别是疟原虫已对多种抗疟药物产生抗药性,致使全球疟疾发病率和死亡率迅速回升,每年有3至5亿疟疾病例和至少一百万人因感染疟疾死亡。应对这一严峻形势,除了采取研发疫苗及新型抗疟药等措施,还迫切需要建立不同地区疟原虫药物抗性基因的突变及其流行规律、起源、分布、分子进化和种群结构等分子流行病学数据库,这对降低疟原虫抗性的影响以及制定相应的防治策略均具有重要作用。研究表明,乙胺嘧啶抗性是由疟原虫二氢叶酸还原酶基因的突变所致,且抗性程度与不同突变的单倍型相关。本研究采集我国不同地区间日疟原虫样本,检测间日疟原虫二氢叶酸还原酶(Pvdhfr)的单核苷酸多态性(SNP)及单倍型,旨在分析我国乙胺嘧啶抗性虫株的流行状况及分布。通过检测Pvdhfr基因侧翼微卫星多态性及间日疟原虫环子孢子蛋白(PvCSP)的基因多态性,探讨我国间日疟原虫乙胺嘧啶抗性基因Pvdhfr突变的起源与传播。间日疟原虫样本采集自我国三个主要疟疾流行区,即云南省、海南省、及华中地区的安徽、河南、湖北省。云南样本主要采集自怒江上下游流域,2005至2009年采集全血/滤纸/玻片样本共计277例;海南样本主要采集自发病率较高的西部及南部山区,2003至2007年采集滤纸/玻片样本共计58例;华中样本均采集于2007至2008年,皖、豫、鄂三省的滤纸样本数分别为252、260和48例。我们选用QIAamp DNA Mini Kit制备基因组DNA。全血及滤纸血样分别按照血液样本及血斑样本实验方案进行处理。玻片样本经85℃预热、溶解后,参照血斑样本实验方案抽提基因组DNA。为确保扩增的灵敏度与特异性,我们设计了两对特异性引物,采用巢式PCR扩增dhfr片段全长。我们对三个地区共计556份样本进行测序,共检测到Pvdhfr基因在7个位点发生了非同义突变,导致第13、57、58、61、99、117和173位氨基酸变异,其中以117N/T突变频率最高,占总样本的69.6%;其它等位基因突变依次为58R、57I/L、61M和99S,分别占总样本的39.2%、29.7%、28.2%和18.9%;173F和13L的突变频率较低,占总样本的1.1%和1.8‰;84例样本未检测出点突变,占总样本的15.1%。另外,在Pvdhfr基因的串联重复序列GGDN岛内,169例样本表现为第98至103位氨基酸缺失,6例样本在第103位氨基酸后表现为18或36个碱基插入。三个地区Pvdhfr基因的SNP和单倍型差异明显。云南地区间日疟样本的突变位点数目和单倍型种类最多。突变位点包括非同义突变13L、57I/L、58R、61M、99S、117N/T、173F与同义突变15A、38G、69Y、134V,单倍型共计18种,其中ILRMHTI和IIRMHTI两种四重突变型流行最广泛,分别占云南地区样本数的35.7%和22.2%;其次为ILSMHTI等三重突变型,占11.7%;IFRTHNI等双重突变型占10.9%;IFSTHNI等单重突变型占13.4%;野生型仅占云南地区样本数的6.1%。52例样本有GGDN岛内第98至103位氨基酸的缺失。所有海南地区间日疟样本皆检测到第58R和117N位点突变,且只表现为一种单倍型IFRTHNI;串联重复序列GGDN岛内均无缺失或插入(indel)。华中地区间日疟样本检测到99S和117N位点突变,但第99位点氨基酸突变与乙胺嘧啶抗性无关。单倍型种类包括野生型IFSTHSI、单重突变型IFSTHNI和IFSTSSI、双重突变型IFSTSNI。在华中地区样本中,河南和安徽均以单重突变型IFSTHNI为主,分别占本省样本数的48.1%和37.1%,而在湖北省样本中野生型占大多数。另外,华中地区间日疟样本在串联重复区表现出相对丰富的indel,安徽、河南、湖北的indel比例分别为39.7%、41.9%和68.75%。此外,在分析我国Pvdhfr基因突变及单倍型的基础上,结合叶酸代谢通路中另一关键靶酶——二氢蝶呤合成酶(Pvdhps)的点突变特征,我们进行了Pvdhfr和dhps基因中各抗性相关突变位点的连锁分析。除Pvdhfr基因58位与117位和Pvdhps基因382位与383位及383位与553位有明显连锁外,5号染色体Pvdhfr基因117位与14号染色体Pvdhps基因383位间存在跨染色体的连锁不平衡,这可能由乙胺嘧啶/磺胺多辛的选择性压力造成,两位点在抗性种群中被固定为静态的连锁位点。为探讨我国间日疟原虫Pvdhfr突变的起源与分子流向,我们检测了其侧翼微卫星多态性。微卫星选择的标准为:构成重复元件的核苷酸数最少为2、最多为5;重复次数最少为8,最大重复单位长度不超过100bp;可选择完全重复型、不完全重复型及复合型;微卫星分布于抗性基因上下游相应区域,位于非编码区。基于以上标准,我们选择了位于dhfr上游93kb、38kb、2.6kb和下游4.9kb、37kb、94kb的六个微卫星,分别命名为u93、u38、u2.6、d4.9、d37和d94。从上述单倍型中选择了4种,即IFSTH/SSI组、IFSTHNI组、IFRTHNI组和II/LRMHTI组,分别代表野生型虫株和不同抗性程度(低、中、高)虫株。根据样本来源地不同,再对IFSTHNI组、IFRTHNI组和II/LRMHTI组单倍型进行华中地区、海南、云南三个地区的进一步分型。每个微卫星位点设计2至3对引物,经巢式或半巢式PCR获得特异性好的目的条带。用QIAxcel毛细管凝胶电泳仪检测后,以软件Bio Calculator进行数据采集与输出。若在某位点出现两个或两个以上峰形,次/主峰比值>1/3且次峰相对峰面积大于30%,即认为存在两个峰值;如重复实验仍无改善,则判断该样本为多克隆感染,从样本分析数据中删除。我们对上述微卫星数据进行以下分析:运用GENALEx、MS tools计算等位基因频率、平均等位基因数目和期望杂合度;运用Network构建中央连接网络图,通过微卫星多态性分析各进化路径的交叉关系,判断多种不同的单倍型是独立起源还是由同一起源经突变累积进化而成。六个微卫星位点均显示出多态性,共检测到57个等位基因。不同抗性程度虫株组在各微卫星位点的等位基因频率、等位基因数目及期望杂合度均有差别。其中,野生型虫株组在各个位点始终保持高度的多态性,杂合度在0.7—0.8之间;低度抗性IFSTHNI组在u2.6位点杂合度值降至0.32,高度抗性II/LRMHTI组在d4.9位点杂合度值降至0.29。以各微卫星位点距Pvdhfr基因的物理距离为横坐标,期望杂合度值为纵坐标绘制散点图,可见各抗性组在毗邻Pvdhfr附近的微卫星处杂合度降低,呈低谷趋势,表明抗性在种群内以选择性扫荡方式扩散。此外,低度抗性IFSTHNI组、中度抗性IFRTHNI组、高度抗性II/LRMHTI组在u2.6位点的主要等位基因型分别为265、260、290/295,在d4.9位点的主要等位基因型分别为112/114、122、112,显示出不同的多态性特征。在与Pvdhfr紧密毗邻的微卫星u2.6位点,II/LRMHTI组杂合度未降低,这是由于等位基因型290和295的平均分布。由地理隔离带或小区间疟疾防治的差异引起四重突变株在省内发生两次不同起源的概率极小,更可能的原因是偏向性突变对总核苷酸数较大的微卫星的限制作用致使微卫星不稳定,故我们认为云南省四重突变株在省内是唯一、独立起源。高度抗性组中两例河南样本HM3、HM4在u2.6位点的微卫星长度与来自华中地区的IFSTHNI组数值相同,推测华中四重突变型仍为本地起源,而非云南省四重突变株输入;根据中度抗性组与高度抗性组在u2.6位点的等位基因频率分布的差异和联系,我们认为海南云南的抗性虫株是经药物压力筛选各自独立产生,但不排除两地不同株系间的输入及重组的可能。利用微卫星数据构建的中央连接网络图显示三种抗性单倍型各自聚集成簇、彼此远离,证实了三地抗性虫株皆为独立起源。我们还选取了IFSTHNI组、IFRTHNI组和II/LRMHTI组中90例样本,进行间日疟环子孢子蛋白(PvCSP)的巢式PCR扩增和测序;CSP蛋白是蚊体内疟原虫对外界信号识别和转导、运动及免疫逃避的重要蛋白,其中央重复基序可反映媒介按蚊与疟原虫的相对适应性。序列分析表明,华中样本与云南海南样本在中央区九肽重复单位的排列组成上差异明显,这极可能与传疟媒介类型有关。我们推测,即使由人员流动等因素造成抗性虫株输入,来自云南或海南的抗性虫株也不能适应华中本地的节肢动物宿主,无法促成新一轮抗性传播。在识别为VK210型的云南和海南样本中,九肽重复单位组成相似;而在为数相对少的、识别为VK247型的云南和海南样本中,九肽重复单位组成虽相似,但中央重复基序后的插入区则显示出序列差异。如前所述,不排除云南海南两地不同株系之间的入侵及重组的可能,但两地间日疟样本在Pvdhfr单倍型和微卫星多态性上的差异表明,本地起源的抗性虫株仍在当地保持绝对优势。小结:我国间日疟原虫在乙胺嘧啶抗性基因Pvdhfr上有广泛的点突变特征。但云南、海南、及华中三地间日疟样本的Pvdhfr基因的SNP和单倍型差异明显。云南地区样本的突变位点数目多、突变频率高、单倍型种类多,提示整体抗性程度较高;海南地区全部样本都含有与抗性密切相关的突变位点,但单倍型固定;华中地区仅发现与抗性相关的单重突变,且所占比例相对较低;以上分子特征与各地乙胺嘧啶用药史和疟疾流行特征吻合。同时,我们识别了三个乙胺嘧啶抗性虫株的起源地—云南、海南和华中地区,抗性在种群内均以选择性扫荡方式传播。海南与云南的抗性虫株经由药物压力筛选、各自独立产生;华中地区出现的四重突变型仍为本地起源,是在单重突变株的基础上积累进化形成。本研究样本的来源地包括南部疟疾高传播区及中部疫情不稳定区,能真实反映我国间日疟原虫乙胺嘧啶抗性流行程度及抗性产生传播状况,为建立我国疟原虫抗药性虫株分子流行病学数据库提供资料;同时证实了微卫星检测和分析技术能够成功运用到间日疟乙胺嘧啶抗药性起源追溯的研究中,为其他疫区的起源鉴定工作提供参考。