家蚕伴性赤蚁基因(sch)的RAPD标记及其标记片段序列分析

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蚕业生产上,由于雄蚕体质强健,虫蛹生命力强,茧层率高,茧丝长,解舒率高,雄蚕出丝率比雌蚕高20%左右,而且雄茧品质好,净度优,纤度细,雄茧缫丝等级高,雄茧单缫比雌雄茧混缫提高两个等级,达5A水平,且节约用桑15%左右,实现单养雄蚕是提高蚕茧品质、降低生产成本的关键措施之一。因此雄蚕品种的选育研究一直是国内外蚕业科学家关注的焦点之一,但迄今为止尚未完全明了sch蚕温敏性与sch在分子水平上的确切关系,还未找到决定sch蚕温敏性的相关基因和蛋白。sch蚕的温敏性是一个复杂的生物学问题,其机理亟待阐明;温敏性状与伴性赤蚁基因(sch)之间的关系也不清楚,限制了其在研究及生产中的利用。从分子水平寻找与sch蚕高温致死性有关的基因和蛋白是阐明其分子机理的关键。 根据已有的研究表明:RAPD标记作为依赖PCR反应的分子标记中的一种手段,能有效、快捷地从未知基因组中获得有关基因的信息。因此在家蚕基因组研究中,可以通过近等位基因系利用以RAPD为核心的核酸扫描技术跟踪目的基因—sch基因。 本研究采用RAPD-PCR技术,利用sch基因及其近等位基因系进行了大量的随机扩增,通过对比,找到了一条能稳定重复的、跟sch基因连锁的特异片段OPD02。为了进一步获取该序列的信息,对该序列进行了克隆、测序以及分析比对。结果表明: 1.这段序列是编码SCP-x的一段DNA序列,并根据测序结果命名为OPD02—759bp。同时,发现该序列只是编码蛋白SCP-x的scp基因的第一个外显子即编码酮酯酰CoA硫解酶(3-ketoacyl-CoA thiolase)的DNA序列得后半部份。 2.设计特异引物进行常规PCR扩增,通过测序、拼接,获得了sch蚕编码酮酯酰CoA硫解酶的完整DNA序列。总共得到的编码区序列为1107bp,翻译后得到的蛋白质为369a.a,分子量为39.3kD。 3.对sch蚕酮酯酰CoA硫解酶的DNA序列进行比对分析以及氨基酸分析。结果是与正常家蚕编码酮酯酰CoA硫解酶的DHA序列有15个核苷酸的差异,翻译后有5个氨基酸的差异。通过与正常家蚕以及其他几个物种的比对分析发现,该差异其中有两个氨基酸突变发生在酮酯酰CoA硫解酶的结构保守区域,并且此突变正好是RAPD扩增时出现特异带的随机引物结合位点,最后对其可能功能进行了探讨。.击农选大争峨去李位掩文 4.根据家蚕数据库中的Bm叹”7278及肠园团21222进行拼接,得到完整的编码家蚕固醉载体蛋白一(steml‘山云er protein一,SCp.x)的cDNA序列,共计16 llbP。翻译后比较结果表明:家蚕固醉载体蛋白一长536‘a,分子量为57.,弘。,等电点PI为6.617,PH7.0时带电量为一1 .82,比脊椎动物(547几a,sgkD)少fl个氨基酸,比果蝇(544 a.a)少8个氨基酸.比较还发现固醉载体蛋白一的N端具有酮酷欲CoA硫解酶活性,C端具有固醉载体蛋白2即SCP.2的功能结构域。 一5.利用D入Astar软件包的决叻hgn将家蚕SCP-x氮墓酸与这些序列进行同源比对,并进行聚类分析和构建分子进化树,分析结果符合传统形态分类。
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