不同类型细胞在骨骺区动态相互作用，通过软骨内骨化的方式促进长骨生长，骨骺区还是骨肉瘤好发部位。其中最常见的细胞类型为骨骺区一侧的肥大软骨细胞以及另一侧的侵入破骨细胞、成骨细胞、及血管内皮细胞。目前对于软骨细胞、成骨细胞、及破骨细胞之间的相互调节在软骨内骨化中的作用了解较多，但对血管内皮细胞在其中的作用了解甚少。我们此前发现内皮细胞敲除ADAM10会导致小鼠长骨生长缺陷，但此生长缺陷的潜在原因并不清楚，此外对于细胞表面金属蛋白酶ADAM10是否在骨肉瘤中起作用仍不明确。ADAM10是Notch信号的主要调节因子，内皮细胞缺乏ADAM10(ADAM10△EC)小鼠视网膜血管结构显示出特征性的血管分支增加，也是Notch信号缺陷所特有的现象。大多数ADAM10△EC小鼠可以存活数月，该动物模型因此提供了研究内皮细胞缺乏ADAM10如何影响长骨生长的独特机会。另一方面，近期研究表明Notch信号通路促进骨肉瘤的形成和肿瘤侵袭，提示作为Notch受体主要脱落酶的ADAM10在骨肉瘤的进展中可能通过影响肿瘤血管生成起作用。本课题旨在比较ADAM10△EC小鼠和对照小鼠不同发育阶段的长骨生长情况，重点研究骨骺区血管内皮细胞、软骨细胞、及破骨细胞可能的形态及分布异常，此外还研究了ADAM10与骨肉瘤进展及血管生成的相关性。第一部分：ADAM10在小鼠长骨发育障碍中的作用材料与方法1.内皮细胞ADAM10敲除(ADAM10△EC)模型小鼠的建立及鉴定。通过将ADAM10lox/lox小鼠与表达内皮细胞特异性Tie2-Cre转基因小鼠杂交，建立ADAM10内皮细胞敲除小鼠(ADAM10△EC，基因型为ADAM10lox/loxTie2-Cre+/-)及正常对照小鼠(Control,基因型为ADAM10lox/loxTie2-Cre-/-)；提取小鼠尾部DNA，PCR法通过检测loxP及Tie2产物鉴定小鼠型别(ADAM10△EC小鼠或对照小鼠)。2. ADAM10△EC小鼠长骨发育缺陷的动态改变。采用Faxitron X射线仪监测ADAM10△EC/对照小鼠不同发育时间点多种长骨发育缺陷的动态变化，并计算松质骨密度改变；茜素红-阿辛蓝大体骨-软骨染色确定敲除ADAM10对长骨的骨及软骨的大体影响；小鼠膝关节骨组织切片HE染色、番红精-固绿软骨染色，确定股骨及胫骨生长板区软骨代谢及软骨细胞改变，并计算内皮细胞敲除ADAM10后对生长板内软骨细胞增生的影响。3.内皮细胞敲除ADAM10对小鼠长骨骨骺区血管发育的影响。利用小鼠内皮细胞特异性endomucin抗体行膝关节骨组织切片免疫荧光染色，对比检测内皮细胞敲除ADAM10后对股骨骨骺区血管形态的改变；通过甲基丙烯酸酯血管铸型构建股骨骨骺区血管三维模型，研究内皮细胞敲除ADAM10对小鼠长骨骨骺区血管发育的三维改变。4. ADAM10在小鼠内皮细胞缺失后对骨骺区破骨细胞的影响及与血管异常的联系。小鼠膝关节骨组织切片TRAP染色，确定内皮细胞缺失ADAM10后骨骺区破骨细胞数目的改变；endomucin-TRAP双重染色，研究ADAM10内皮细胞敲除后血管发育异常与破骨细胞改变的相关性。5.敲除小鼠内皮细胞ADAM10对破骨细胞分化的影响。分离ADAM10△EC/对照小鼠股骨及胫骨骨髓细胞，体外用巨噬细胞-击落刺激因子(M-CSF)分化培养为巨噬细胞，加入/不加入RANKL继续分化为破骨细胞，TRAP染色确定破骨细胞数目及形态改变。6.小鼠内皮细胞敲除ADAM10对骨骺区RANKL/OPG信号通路的影响。分离ADAM10△EC/对照小鼠上下肢骨骺区软骨并提取RNA，实时定量逆转录PCR(real timequantitative RT-PCR)mRNA水平检测RANKL/OPG比值改变，以确定RANKL/OPG信号通路对ADAM10内皮细胞敲除引起的破骨细胞改变的影响。结果1. ADAM10内皮细胞敲除导致小鼠多个长骨发育障碍。Faxitron X线摄片长度测量分析显示，小鼠内皮细胞缺失ADAM10导致股骨及胫骨最早于生后7天明显短缩(P7)，其中股骨短缩随时间进展明显加重，肱骨、尺骨、桡骨于生后14天开始明显短缩，而上肢掌骨在所有监测时间点(P7-P183)均无明显短缩；骨密度分析显示ADAM10△EC小鼠股骨及胫骨生长板下骨松质密度均显著增高，分别始于P28及P21。2. ADAM10敲除导致长骨生长板结构异常。小鼠膝关节骨组织切片HE染色显示，与对照小鼠相比ADAM10△EC小鼠股骨生长板生后7天及14天未见明显异常，生长板后方在生后21天则开始出现不连续，至生后28天生长板后方进展为局部中断，而生长板前方肥大软骨细胞层则表现为不规则增厚，此外HE染色还显示骨松质密度增加导致ADAM10△EC小鼠股骨髓腔较对照小鼠明显变窄，生后42天出现整个生长板区多个部位显著中断；ADAM10△EC小鼠胫骨生长板于生后14天开始出现不同于股骨生长板改变的中央型肥大软骨细胞层明显增厚，一直持续至监测到的生后42天，并导致生长板下骨缺损。番红精-固绿软骨染色显示生后21天ADAM10△EC小鼠股骨及胫骨生长板增生软骨细胞层开始出现软骨合成减少。茜素红-阿辛蓝全组织染色显示ADAM10△EC小鼠生后42天股骨远端骨骺线出现早闭。3.小鼠内皮细胞中缺失ADAM10导致骨骺区血管发育紊乱。免疫荧光染色显示ADAM10△EC小鼠股骨骨骺区于生后14天出现endomucin荧光抗体显著增强，分析显示骨骺区血管密度显著增加，生后21天生长板中断处证实有血管侵入，至28天生长板被贯穿处上下侧均发现有血管侵入，胫骨骨骺区则出现襻样血管团，或于增厚的生长板下方出现血管缺失；相较ADAM10△EC小鼠而言，对照小鼠骨骺区血管分布规则、均匀，且endomucin荧光染色较浅；甲基丙烯酸酯血管铸型解剖显微镜下显示对照小鼠股骨血管为单个大的中央动脉延伸至骨骺区分支为逐渐增多的规则、平行、细小的血管环，而ADAM10△EC小鼠股骨血管铸型则显示骨骺区血管分布杂乱、交错，以及多处小的血管球样扩张。4. ADAM10△EC小鼠长骨发育障碍由骨骺区破骨细胞数目明显减少引起。TRAP染色显示在ADAM10△EC小鼠股骨骨骺区，生后7天及14天破骨细胞数目及分布较对照小鼠无明显改变，生后21天破骨细胞数目开始出现显著减少直至28天，胫骨骨骺区破骨细胞变化与股骨类似。5. ADAM10内皮细胞缺失引起的骨骺区破骨细胞数目减少与血管发育紊乱密切相关。Endomucin-TRAP双重染色显示，生后14天及28天股骨骨骺区TRAP+破骨细胞与endomucin+内皮细胞在空间位置上紧密联系，14天血管密度明显增加而破骨细胞数目未见明显减少；28天同样可见相似的血管密度增加，但股骨骨骺区破骨细胞数目则显著减少。6.内皮细胞缺失ADAM10导致小鼠体外破骨细胞分化能力下降，但RANKL/OPG信号通路未受影响。体外破骨细胞细胞分化实验表明ADAM10△EC小鼠来源于股骨及胫骨的骨髓细胞破骨细胞生成较对照小鼠稍延迟，导致TRAP+破骨细胞数目出现少量但统计学显著的减少，而来源于小鼠上下肢骨骺区组织的定量PCR结果显示ADAM10△EC小鼠与对照小鼠RANKL/OPG比值无显著性差异。第二部分：ADAM10在骨肉瘤进展中的作用材料与方法1.骨肉瘤样本。主要样本来源于购买的组织芯片，每张包含40例人骨肉瘤组织块(多聚甲醛处理，石蜡包埋)病理分期从IA至IIB期，组织类型包括：骨母细胞型骨肉瘤、软骨母细胞型骨肉瘤、纤维母细胞型骨肉瘤、以及富含巨细胞骨肉瘤；部分石蜡包埋组织来源于本院病理科。2.常规HE染色。确定肿瘤组织来源、形态、及病理类型。3.免疫荧光染色。抗CD31、抗胞内ADAM10、抗胞内段/活化Notch1(Notch1intracellular domain, NICD)，DAPI(胞核染色)，免疫荧光染色骨肉瘤组织切片，并计算CD31、NICD表达强度，血管分支数目及ADAM10阳性细胞数目与肿瘤分期及组织类型的相关性；双重免疫荧光染色(CD31/ADAM10, CD31/NICD)研究ADAM10/Notch1表达与肿瘤血管内皮细胞之间的关系。4. TRAP染色。确定破骨细胞在骨肉瘤组织中的表达情况，并明确富含巨细胞骨肉瘤中的破骨细胞样多核巨细胞是否为破骨细胞。结果1. ADAM10在肿瘤细胞中的表达与骨肉瘤的进展呈正相关。在所有骨肉瘤分期及病例中均发现有ADAM10局部聚集表达于骨肉瘤细胞中，随着骨肉瘤从IA期进展为IIB期，ADAM10+肿瘤细胞数目也显著增加，IIA和IIB期的ADAM10+肿瘤细胞数目平均值较IA期显著升高；此外骨母细胞型骨肉瘤中ADAM10+肿瘤细胞也显著多于软骨母细胞型骨肉瘤及纤维母细胞型骨肉瘤。2. IA/IB期骨肉瘤存在一类血管原性肿瘤细胞，可能通过“胞质内陷”方式形成血管管腔。HE染色发现IA/IB期骨肉瘤中存在一类嗜碱性圆形肿瘤细胞，CD31染色呈阳性，证明其为血管原性，其中部分肿瘤细胞出现不同阶段的“胞质内陷”，可能为形成血管管腔的一种机制，同时ADAM10也均一表达于这类细胞胞质中。3.富含巨细胞骨肉瘤中的破骨细胞样多核巨细胞并非破骨细胞，而是血管原性肿瘤细胞，涉及ADAM10/Notch1信号活化。TRAP/DAPI双重染色证明富含巨细胞骨肉瘤中的多核巨细胞TRAP染色阴性，而骨母细胞型骨肉瘤、软骨母细胞型骨肉瘤及纤维母细胞型骨肉瘤中均含TRAP+肿瘤细胞。CD31以中度水平均一表达于巨细胞胞质中，ADAM10和活化的Notch1也共同表达于巨细胞中，其表达模式与CD31类似。4.部分骨肉瘤血管结构内皮缺失。CD31染色发现IA期-IIB期部分骨肉瘤血管结构中红细胞未被血管内皮包绕，但血管内皮CD31染色阳性，证明其中并非由于血管内皮不表达CD31而是因为血管内皮缺失造成，其形成可能与多核巨细胞相关。结论1.生长板区血管在调节破骨细胞仅在诸如股骨、肱骨、胫骨、尺骨、以及桡骨这些较大长骨的发育后期显现出作用。2.内皮细胞中ADAM10对于长骨中特化的血管在软骨内骨化中的正常发育及功能是必需的。3. ADAM10△EC小鼠长骨骨骺区破骨细胞数目的减少很有可能是由ADAM10缺乏导致Notch信号异常，引起血管内皮细胞分化障碍，导致血管结构异常造成的，而不是由ADAM10缺乏导致血管内皮释放RANKL等可溶性因子缺陷造成的。4. ADAM10在肿瘤细胞中的表达与骨肉瘤进展正相关。5. IA/IB期骨肉瘤中存在一类血管原性肿瘤细胞，可能通过“胞质内陷”形成血管管腔，ADAM10参与其中。6.富含巨细胞骨肉瘤中破骨细胞样多核巨细胞并非破骨细胞，而是一种血管原性细胞，其中涉及ADAM10/Notch1信号活化；该细胞可能与骨肉瘤血管内皮缺失有关。