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目的:研究三苯氧胺(TAM)是否对雌激素受体阴性的乳腺癌细胞具有生长抑制和诱导凋亡作用.观察不同浓度三苯氧胺作用不同时间后,对ER阴性的MA782小鼠乳腺癌细胞细胞周期正负凋节因子细胞周期素D1(cyclin D1)、细胞周期素依赖性激酶4(cdk4)、细胞周期素依赖性激酶抑制因子(p21/WAF1/CIP1以下简称p21)、增殖细胞核抗原(PCNA)、转化生长因子(TGF-β1)蛋白表达的影响.探讨三苯氧胺诱导MA782细胞凋亡的分子作用机制,揭示细胞周期正负调控因子在乳腺肿瘤的发生、发展以及乳腺癌治疗方面所起的作用.对临床内分泌治疗雌激素受体阴性的乳腺癌患者,提供新的启示和实验依据.方法:(1)细胞培养:常规培养MA782细胞,观察细胞一般生物学特性.实验分对照组(只加RPMI1640配养基,不加TAM)和 TAM诱导组(按不同浓度和不同作用时间点分组).(2)细胞增殖活性检测(MTT法):用MTT法检测对照组及各实验组细胞增殖活性.(3)流式细胞仪检测(FCM):收集对照组及各实验组细胞标本,用流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期时相分布情况.(4)免疫细胞化学染色(ICC):用免疫细胞化学染色法(SABC法)鉴定MA782细胞雌激素受体及上述相应蛋白表达情况,并用病理图像分析软件进行半定量分析.(5)RT-PCR:用RT-PCR方法检测cyclin D1mRNA,TGF-β1 mRNA表达变化.结果:(1)细胞培养结果显示:MA782细胞具有肿瘤细胞的一般生物学特性,25ml培养瓶接种1.2×105个细胞,培养五天达到增殖高峰,第六天细胞生长开始出现接触性抑制.(2)MTT检测结果显示:2 μmol/L TAM对细胞没有明显影响,6、10 μmol/L TAM则对细胞有不同程度的生长抑制作用,与对照组相比差异显著(P<0.01),且与TAM浓度和作用时间呈正相关.(3)FCM检测结果显示:2 μmol/L TAM作用于MA782细胞24小时后未出现凋亡峰,而6、10 μmol/L TAM作用24小时后则出现凋亡峰,细胞凋亡率分别为7.04％、19.04％.10 μmol/L TAM作用48小时后细胞凋亡率从19.04％上升到51.27％.G0/G1期比例随TAM浓度增加、作用时间延长从19.83％上升到98.69％.S期比例从80.17％下降到0％.说明三苯氧胺对MA782细胞有明显的G0/G1期阻滞作用.(4)免疫细胞化学染色结果显示:MA782细胞雌激素受体阴性.2 μmol/L TAM作用不同时间后,细胞无明显上述蛋白变化,6、10μmol/LTAM作用不同时间后,细胞cyclin D1、cdk4、PCNA蛋白表达均有不同程度的下降,与对照组相比差异显著(P<0.05或P<0.01),而p21,TGF-β1蛋白表达则有不同程度的上升,与对照组相比亦差异显著(P<0.05或P<0.01).(5)RT-PCR检测结果显示:2 μmol/LTAM组无明显改变,而6、10 μmol/LTAM作用于细胞24、48小时后,细胞cyclin D1mRNA和TGF-β1mRNA表现出不同程度的变化,与对照组比较有统计学意义(P<0.05或P<0.01).结论:(1)TAM浓度大于2μmol/L时,对ER阴性的MA782小鼠乳腺癌细胞有明显的生长抑制和诱导凋亡作用.(2)MA782细胞cyclin D1、cdk4、PCNA免疫组化染色均呈强阳性,p21、TGF-β 1亦呈阳性,表明上述指标均有不同程度的过表达现象,说明MA782细胞存在细胞周期紊乱.(3)TAM可下调MA782细胞cyclin D1、cdk4、PCNA蛋白表达,上调p21、TGF-β1表达,使细胞阻滞在G0/G1期,提示TAM可通过调节细胞周期正负凋节因子的表达来抑制ER(-)乳腺癌细胞的生长,诱导其凋亡.(4)上述结果从理论上提供了TAM治疗ER阴性乳腺癌患者的可能性,但在临床应用前仍需进一步的研究.