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目的:本文拟以连接反应和环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)为基础,构建基于连接反应的环介导等温扩增新方法,实现KRAS基因突变的高灵敏、高特异性检测。方法:本研究首先对本方法的可行性进行了验证。研究中突变KRAS DNA(mutant DNA,mut DNA)能够与连接底物SLS1和SLS2互补配对,在连接酶的作用下,特异地连接而形成哑铃状结构(dumbbell-shaped structure,DSS)模板,从而启动下一步LAMP的扩增反应,产生大量长短不一的DNA双链,这时荧光染料SYBR Green I镶嵌到产生的DNA双链中产生明显的荧光信号。而与mut DNA相比,野生型KRAS DNA(wild-type DNA,wt DNA)与SLS2之间多了一个错配碱基,导致连接反应不能进行,不能进行后续的LAMP放大,产生微弱的荧光信号,由此对mut DNA和wt DNA进行区分。在明确方案可行后,对实验中的错配位点、连接温度、连接循环次数、Bst DNA聚合酶浓度和LAMP温度进行了优化,然后在最优实验条件下对本方案的线性范围和特异性进行了探究;最后将本方案运用到临床样本的检测中,并与PCR的检测结果进行比对。结果:本研究成功构建了一种基于连接反应的环介导等温扩增新方法用于KRAS基因突变的检测。在最佳的实验条件下(错配位点:第三个位点、连接温度:63°C、循环次数:30个循环、Bst DNA聚合酶浓度:0.4 U/μL、LAMP温度:65°C),本方案具有较高的灵敏度和特异性。mut DNA浓度与拐点值(point of inflection,POI)在10 a M到100 p M之间有一个良好的线性关系;在与大量的wt DNA混合的情况下,可以检测到低至0.1%的mut DNA。此外,本方法对结直肠癌组织样本突变检测的结果与PCR方法的检测结果一致,两者有较好的相关性。结论:本研究所提出的基于连接的环介导等温扩增方法对突变的检测有很大潜力,有望应用于疾病诊断、个体化医疗和生物医学研究等领域,最终为生物研究和临床疾病的诊疗提供有力的技术支持。