小麦玉米蠕形孢真菌的分子检测及小麦根腐蠕孢Tup1基因功能的研究

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蠕形孢真菌能够在小麦玉米等禾本科植物上引起许多的重要病害,这些病害能够对小麦和玉米的产量造成较大的损失,严重威胁我国的粮食安全。小麦玉米蠕形孢真菌病害主要有玉米大、小斑病、玉米圆斑病、玉米弯孢霉叶斑病以及小麦根腐病,这些病害在发病前期不易被发现和识别且症状相似,常规的病原鉴定和检测技术耗时耗力,因此快速,准确并且较早的检测这五种病原菌,对防治这五种病害将会起到巨大作用。本研究通过对自己设计和已报道的特异性引物进行探究,建立了小麦玉米常见蠕形孢真菌的分子检测体系。主要结果如下:(1)玉米小斑病和圆斑病病原分子检测通过对玉蜀黍平脐蠕孢菌(Bipolaris maydis)、玉米生平脐蠕孢菌(B.zeicola)及其近似种的延长因子1α基因(elongation factor 1α,EF-1α)部分序列进行比对,设计出B.maydis的特异性引物X-EF-F/X-EF-R和B.zeicola的特异性引物Y-EF-F/Y-EF-R,利用这两对引物可以从B.maydis和B.zeicola中分别扩增出205bp和137bp的特异片段,而其余的17个参试菌株扩增结果为阴性。灵敏度实验表明这两对引物可以检测到目标DNA的浓度为10pg·μl-1和1 pg·μl-1;玉蜀黍平脐蠕孢经巢式PCR反应,该引物的灵敏度可提高到0.1 pg·μl-1。用B.maydis和B.zeicola接种玉米组织,然后利用这两对特异性引物对发病组织进行PCR检测,可以从发病组织中检测到目的菌株的条带,而健康玉米组织DNA中未能扩增出任何条带。B.maydis和B.zeicola孢子悬浮液接种大田玉米叶片,接种第3 d都可以检测到各自未发病组织中的该病原菌。从郑州、安阳、西平、淮阳以及唐河随机采取了一些玉米病叶,直接提取玉米叶片的总DNA用两对特异性引物进行PCR检测。检测结果显示:在郑州的样品中检测到B.maydis,而未检测到B.zeicola,其它地区都未检测到该两种病原菌。(2)玉米叶部部分重要病害的多重检测利用玉蜀黍平脐蠕孢菌(B.maydis)设计的特异性引物X-EF-F/X-EF-R,同时参考玉米凸脐蠕孢(Exserohilum turcicum)特异性引物JB586/JB589及新月弯孢(Curvalaria lunata)的特异性引物ClgD2/ClgD3,建立了玉米叶部3种重要病害的多重检测体系。实验结果表明:利用X-EF-F/X-EF-R、JB586/JB5893及ClgD2/ClgD3这3对特异性引物,可以从混合DNA中很好的检测到这3种菌。利用玉米生平脐蠕孢菌(B.zeicola)设计的特异性引物Y-EF-F/Y-EF-R,同时参考玉米凸脐蠕孢(E.turcicum)特异性引物JB586/JB589及新月弯孢(C.lunata)的特异性引物ClgD2/ClgD3,建立了玉米叶部3种重要病害的多重检测体系。实验结果表明:利用Y-EF-F/Y-EF-R、JB586/JB5893及ClgD2/ClgD3这3对特异性引物,也可以从混合DNA中很好的检测到这3种菌。(3)小麦根腐蠕孢Tup1基因的功能研究由小麦根腐蠕孢菌(B.sorokiniana)引起的根腐病能够对小麦的产量造成重大的损失。近年来,随着小麦秸秆还田病原菌的逐年累计,目前该病害呈现了扩大发生的趋势。鉴于小麦根腐蠕孢较难防治且能对小麦产量的巨大危害性,因此对该原菌的致病机制的研究具有重要的意义。本研究以转录阻遏物的核心基因Tup1为切入点,通过同源重组的方法对Tup1基因进行了敲除,利用反向遗传学的方法,初步探索了小麦根腐蠕孢Tup1基因的功能。通过报告基因和同源重组相结合的基因敲除策略获得该基因缺失突变体,并用southern杂交的方法进行了进一步验证。通过和野生型相比发现敲除突变体的生长速率明显减慢;缺失突变体不能产孢,且菌丝膨大畸形,同时其对过氧化氢和KCl的压力筛选非常敏感;使用突变体菌块接种无伤的大小麦叶片和茎基部,均不能引起小麦和大麦发病;釆用创伤接种的方法,发现突变体在小麦和大麦上致病性均显著下降。上述结果表明,小麦根腐蠕孢Tup1基因参与调控小麦根腐蠕孢菌的生长发育和其对大小麦的致病性。
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