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背景缺血性脑血管病是老年人当中最为常见的疾病,死亡率高,致残率高,存活下来的人大部分都会遗留有不同程度的功能障碍,给家庭和社会带来沉重负担。遗憾的是,到目前为止,对缺血性脑损伤具体机制还不完全清楚。溶栓治疗是目前治疗脑梗死的首选方法,但由于时间窗和技术条件的限制,绝大多数病人无法从中获益。除此之外,脑梗死治疗尚无十分有效的方法。研究证实,干细胞可以减轻缺血性脑损伤,有关机制尚不明了。PI3K/Akt是一条经典的抗凋亡通路,其与缺血性脑损伤也有密切的关系,有研究表明该通路的激活可以减轻缺血后的脑损伤。但人脐血间充质干细胞是否能激活这一通路,通过该通路调节缺血后炎性反应,抑制神经细胞凋亡,保护神经细胞,经文献检索目前尚未见相关报道。本研究拟观察脐血间充质干细胞移植对大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型血清炎性因子水平、Bcl-2、Bax表达的变化、神经细胞凋’亡情况、PI3K/Akt信号通路的表达情况及神经功能评分,探讨脐血间充质干细胞是否能通过调节PI3K/Akt信号通路,减轻缺血性脑损伤后炎性反应,抑制细胞凋亡,改善大鼠的神经功能。第一部分:人脐血间充质干细胞移植治疗对缺血性脑损伤大鼠的神经保护作用目的观察人脐血间充质干细胞移植对缺血性脑损伤大鼠炎性反应的调节、神经功能及细胞凋亡的影响方法选用清洁级成年SD雄性大鼠,采用改良的线栓法制备左侧大脑中动脉栓塞模型。将大鼠随机分为假手术组、模型组、生理盐水组,干细胞组,每组15只,实验周期2周。假手术组:手术过程操作同模型组,但不插线栓塞。模型组:制备大脑中动脉栓塞模型,不接受任何治疗。生理盐水组:在制备大脑中动脉栓塞模型成功后24小时,经左侧股静脉注射生理盐水lml。干细胞组:在制备大脑中动脉栓塞注模型成功后24小时,经左侧股静脉注射第6代脐带血干细胞生理盐水稀释液1ml (细胞数为3×106个)。所有大鼠均在缺血前经尾静脉抽血备用,用mNSS方法进行神经功能评分,剔除不合格大鼠,造模后24小时、3天、7天、14天时间点抽血备用,采用mNSS评分评估神经功能缺损情况;所有大鼠在完成神经功能评分后断头处死行HE染色观察神经病理形态变化,细胞原位凋亡(TUNEL)检测细胞凋亡情况。结果1、神经功能缺损评分假手术组大鼠神经功能在各时间点无明显变化;模型组、生理盐水组、干细胞组在造模后各个时间点上mNSS评分均明显高于假手术组(P<0. 05),在缺血后24小时,模型组、生理盐水组和干细胞组三组之间神经功能评分无明显差异,缺血后3天、7天及14天时,干细胞组神经功能评分均明显低于模型组和生理盐水组(P<0. 05)。2、炎性因子水平在各观察时间点上,假手术组各观察值无明显变化,缺血后各时间点上模型组和生理盐水组血清中的IL-10和TGF-β 1水平显著降低,IL-10水平在缺血后24小时最低,TGF-β 1水平在缺血后3天最低,经干细胞移植治疗后血清中IL-10水平明显升高,缺血后3天升高到最高值,随后逐渐回落,7天时高于假手术组(P<0. 05),至14天时基本恢复到正常水平;干细胞组TGF-β1水平缺血后3天也明显高于模型组、生理盐水组和假手术组(P<0. 05),之后快速回落,略低于假手术组(P>0.05),但明显高于模型组和生理盐水组(P<0.05); IL-6和IFN-γ水平在假手术组各观察点无显著变化,在造模后,其水平显著升高,缺血后24小时是最高,随后缓慢回落,14天时仍未恢复至正常水平,仍明显高于假手术组(P<0.05),相比较而言,干细胞组的IL-6和IFN-γ水平在缺血后3天、7天和14天明显低于模型组和生理盐水组(P<0. 05),与假手术组相比无显著差异。3、TUNEL 染色假手术组细胞形态在各时间点均无明显病理变化;模型组和生理盐水组梗死周围组织较多坏死,可见较多深染、固缩核细胞;干细胞组也出现了和模型组及生理盐水组类似病理变化,但梗死周围的组织坏死及细胞凋亡情况均轻于后两者,TUNEL阳性细胞明显低于模型组及生理盐水组,差异有统计学意义(p<0. 05)。结论早期(缺血后24小时)进行人脐血间充质干细胞移植治疗缺血性脑损伤大鼠,可以调节缺血后的炎性反应,减轻细胞凋亡,改善神经功能评分,促进神经功能恢复。第二部分:人脐血间充质干细胞通过PI3K/AKt信号通路调节缺血性脑损伤大鼠炎性反应和抑制神经细胞凋亡目的观察脐血间充质干细胞对缺血性脑损伤大鼠的PI3K/AKt信号通路调节、炎性因子及细胞凋亡的影响方法清洁级成年SD雄性大鼠随机分为随机分为假手术组、模型组、干细胞+LY组,干细胞组,每组15只,实验周期2周。采用改良的线栓法制备左侧大脑中动脉栓塞模型。假手术组:手术过程操作同模型组,但不插线栓塞。模型组:制备大脑中动脉栓塞模型,不接受任何治疗。干细胞+LY组:在制备大脑中动脉栓塞模型成功后24小时经左侧股静脉注0. 1mlLY294002稀释液和脐带血干细胞生理盐水稀释液1ml (细胞数为3X106个)。干细胞组:在制备大脑中动脉栓塞模型成功后24小时经左侧股静脉注射第6代脐带血干细胞生理盐水稀释液1ml (细胞数为3×106个)。所有大鼠均在缺血前经尾静脉抽血备用,用mNSS方法进行神经功能评分,造模成功后24小时、3天、7天、14天时间点抽血备用,采用mNSS方法评估神经功能缺损情况;完成神经功能评分后,所有大鼠断头处死,部分脑组织用Western blot法检测缺血测额叶组织Akt、P-Akt的表达量,部分脑组织行细胞原位凋亡(TUNEL)检测细胞凋亡情况结果1、神经功能缺损评分假手术组大鼠神经功能在各时间点无明显变化;模型组、干细胞+LY组、干细胞组在缺血后各时间点均高于假手术组,在移植前(缺血后24小时),模型组、干细胞+LY组和干细胞组三组之间无明显差异,而在移植后(缺血后3天、7天、14天),模型组评分仍居高不下,在四组中评分最高,干细胞+LY组评分降低,明显低于模型组(P<0. 05),但显著高于干细胞组(P<0. 05)。2、炎性因子水平在缺血后各观察时间点上,假手术组各观察值无明显变化,模型组血清中的IL-10和TGF-β1水平明显降低,IL-6和IFN-γ水平明显升高。移植后(缺血后3天、7天、14天),干细胞组血清中IL-10和TGF-β1水平明显升高,明显高于模型组和干细胞+LY组(P<0.05),而干细胞+LY组血清中的IL-10和TGF-β1水平高于模型组(P<0.05)。IL-6和IFN-γ水平在移植后(缺血后3天、7天、14天)明显下降,干细胞组下降更为明显,其水平明显低于模型组和干细胞+LY组(P<0.05),干细胞+LY组则明显低于模型组(P<0.05)。3、p-Akt、Akt 变化缺血后,模型组p-Akt蛋白表达水平升高,与假手术组相比有显著差异(P<0.05 );干细胞组和干细胞+LY组p-Akt的表达水平升高更为明显,且干细胞+LY组p-Akt蛋白表达水平高于模型组(P<0.05 ),低于干细胞组(P<0.05 )。对总Akt蛋白而言,四组的表达均无明显差异。4、Bcl-2、Bax 变化模型组Bcl-2和Bax表达水平均有提高,Bax升高更为明显,与假手术组相比具有显著差异(P<0.05 )。干细胞+LY组Bcl-2表达水平高于模型组(P<0.05 ),而Bax水平低于模型组(P<0. 05);干细胞组Bcl-2水平较干细胞+LY组升高更为明显,明显高于后者(P<0.05 ),而Bax水平则显著降低至正常水平,明显低于干细胞+LY组(P<0. 05 )。5、TUNEL 染色假手术组细胞形态在各时间点均无明显病理变化,细胞形态正常,未见TUNEL阳性细胞,其余三组均出现了不同程度的细胞凋亡情况,干细胞组细胞凋亡情况最轻,凋亡指数明显低于模型组和干细胞+LY组(p<0.05),干细胞+LY组细胞凋亡情况介于干细胞组和模型组之间,凋亡指数明显低于模型组(p<0. 05)。结论人脐血间充质干细胞可通过PI3K/AKt信号通路调节大鼠缺血性脑损伤后炎性反应,促进Bcl-2的表达,减少Bax的表达,抑制细胞凋亡,改善大鼠的神经功能,减轻缺血性脑损伤。