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桉树原产澳大利亚,是桃金娘科(Myrtaceae)杯果木属(Angophora)、伞房属(Corymbia)和桉属(Eucalyptus)植物的统称。桉树生长快、对环境的适应能力强,是主要的实木与纸浆用材,由于轮伐期短,经济效益高,现已在热带、亚热带地区广泛种植。到2011年,中国桉树种植面积已有368万hm2。尾巨桉是尾叶桉(Eucalyptus urophylla)与巨桉(E. grandis)杂交种,树高50m以上,用途广泛,主要用于造纸与实木用材,是栽培面积最大的桉树人工林无性系。近年来随着桉树人工林的不断扩大,病虫害严重,已成为制约桉树人工林发展的主要因素。传统化学防治方法对环境的副作用大,破坏生态安全。利用包括转基因技术在内的现代生物技术手段进行桉树育种具有高效性和针对性,加快优质高抗新种质的选育。N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones, AHL)是革兰氏阴性病原细菌产生的小分子化合物,也是该类病原菌群体感应系统的关键信号分子。当病原菌产生的AHL达到一定量浓度时,可激活病菌的致病基因表达,使寄主植物感病并表现相应病症。因此,破坏病原菌AHL信号分子可达到降低病原菌致病力的作用。以尾巨桉优良无性系无菌苗茎段为外植体,通过对噻唑基脲类新型分裂素(N-phenyl-N’-[6-(2-chlorobenzothiazol)-yl] urea, PBU)等多种不同浓度生长调节剂组合的优化,进行胚性愈伤组织诱导及再生研究。结果表明,在添加了2mg-L-1PBU和0.05mg·L-1IAA的改良MS培养基上,茎段外植体5d后愈伤组织诱导率达96%以上。将愈伤组织接种在添加1mg·L-16-BA和0.05mg·L-1NAA的MS培养基上,诱芽率达90.8%。随后在添加了0.8mg·L-1PBU与0.05mg·L-1IAA的1/2MS培养基上诱导芽伸长,用1/2MS培养基附加0.5mg·L-1IBA诱导生根,移栽后得到完整再生植株。通过对尾巨桉胚性与非胚性愈伤组织差异的比较研究,初步揭示了尾巨桉愈伤组织的非胚性化表型的相关基因表达变化以及愈伤组织非胚性化是受环境胁迫影响的本质。芽孢杆菌中的aiiA基因编码AHL-Lactonase能够水解信号分子AHLs。利用PCR方法从枯草芽孢杆菌中克隆了aiiA基因,序列分析表明该基因由753个碱基组成,编码含有250个氨基酸残基的蛋白质,核苷酸序列与已报道aiiA勺同源性为87%～96%。将该基因置于诱导型启动子PPP3调控下,连接到植物表达载体pCAMB1A1301中,成功构建了aiiA基因的植物诱导表达载体pCAMBIA-PPP3-aii4,为进一步通过转基因技术研究该基因的功能奠定了基础。本研究选用了pGEX-4T-1表达载体,构建重组原核表达载体pGEX+aiiA。表达条件优化结果表明,在25℃下用0.2mmol·L-1IPTG诱导9h,蛋白的表达量最大,获得AIIA融合蛋白。研究表明AIIA蛋白能够降解细菌的AHL信号分子,猝灭细菌的群体感应,明显减弱病菌的致病力。根据已报导的PPP3启动子碱基序列设计引物,从烟草基因组中扩增得到启动子PPP3。用PPP3替换pCAMBIA1301中与gus基因相连的35S启动子,构建重组质粒后导入农杆菌GV3101。通过农杆菌介导的瞬时表达技术将受PPP3控制的gus基因导入烟草。分别接种青枯菌和水杨酸,24h后烟草叶片中检测到gus基因转录水平分别提高了27.94和17.69倍。表明PPP3具有诱导表达活性。经农杆菌介导法将表达载体pCAMBIA+PPP3+aiiA、pCAMBIA+35S+aiiA转化尾巨桉,得到了转基因植株。经PCR和Southern blotting证明aiiA基因成功插入到尾巨桉基因组中。Northern blotting和RT-PCR结果显示,在PPP3的调控下,aiiA受到诱导表达。实时荧光定量PCR结果表明,转基因尾巨桉接种青枯菌、茎腐病和焦枯病后,aiiA基因转录效率分别提高到原来的43.88、30.65和18.95倍。灌根接种青枯菌和焦枯菌,转aiiA基因尾巨桉抗病性明显的增强,分别提高2.5和2.1个抗性级别,评价为中等抗病水平,表现为发病时间延迟,病情指数降低,抗性相关酶活性显著增强。灌根接种疫霉菌孢子,转基因植株表现出发病延迟、病情进展缓慢等抗病特点。转PPP3+aiiA基因植株抗性提高级别数要高于35S+aiiA基因植株,诱导抗性高于组成型表达。说明通过在植株中诱导表达群体猝灭基因,是提高植物抗病能力的有效策略。