几个蓝莓品种离体叶片再生及遗传转化体系的优化

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蓝莓(Vaccinium spp.)是一种极具经济价值和保健价值的果实,随着市场多样化需求的增加,通过生物技术育种,提升蓝莓果实产量和品质迫在眉睫。利用生物技术进行的根癌农杆菌介导的植物遗传转化已经在多种果树中成功应用,但在蓝莓中仍然存在品种转化效率低下、转化困难等问题。本研究以高丛蓝莓品种‘北陆’(Northland)、‘圣蓝’(Millennia)、‘喜来’(Sierra)、‘莱格西’(Legacy)、‘蓝源’(Bluesouth)为材料,通过不同激素组合和浓度试验,优化蓝莓叶片不定芽再生体系及建立蓝莓叶片愈伤组织再生体系;通过分析根癌农杆菌侵染浓度和时间、共培养天数、抑菌剂浓度等因子的影响效果,以期对蓝莓遗传转化体系进行优化,为后续蓝莓基因功能的研究和育种工作提供技术支撑。主要研究结果如下:(1)优化了4个蓝莓品种‘北陆’、‘圣蓝’、‘喜来’、‘莱格西’叶片再生不定芽体系,筛选出4个品种诱导不定芽培养基以WPM+4.0 mg/L ZT+30 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂粉为佳。其中,‘北陆’叶片不定芽诱导率为60%,‘圣蓝’叶片不定芽诱导率为81.67%,‘喜来’叶片不定芽诱导率为83.33%,‘莱格西’叶片不定芽诱导率为26.67%。(2)成功诱导‘北陆’、‘莱格西’两个品种的叶片愈伤组织,叶片诱导愈伤组织培养基以WPM+1.0 mg/L 2,4-D+0.4 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂粉为佳,光照条件以黑暗培养效果为佳,叶片愈伤组织诱导率可达到100%。(3)成功继代‘北陆’、‘莱格西’两个品种的叶片愈伤组织,愈伤组织继代培养基以WPM+1.5 mg/L 2,4-D+0.4 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂粉为佳,光照条件以黑暗培养效果为佳。(4)针对蓝莓遗传转化中的卡那霉素筛选浓度、农杆菌侵染浓度和侵染时间、抑菌剂浓度进行了优化试验,筛选出‘北陆’和‘圣蓝’叶片卡那霉素最优浓度分别是15mg/L和20 mg/L;农杆菌侵染OD600值分别为0.9和0.3-0.4;侵染时间为60 min,共培养时间为6 d;脱菌使用WPM+300 mg/L头孢噻肟钠(Cef)与WPM+4.0 mg/L ZT液体培养基搭配;筛选培养基使用WPM+4.0 mg/L ZT+300 mg/L Cef+卡那霉素,诱导周期为50-60 d,蓝莓叶片存活率最高,能直接再生出卡那霉素抗性芽。其中农杆菌OD600值为0.3时,‘圣蓝’抗性芽诱导率为2%,OD600值为0.4时,‘圣蓝’抗性芽诱导率为2.04%;OD600值为0.9时,‘北陆’抗性芽诱导率为2.5%。
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