目的:补肾壮骨汤是临床上广泛应用于治疗骨质疏松的经典方剂。目前,对补肾壮骨汤的研究大多集中在临床疗效上,但缺乏对药效物质和作用机制的研究。本研究在临床疗效的基础上,结合循证医学、生物信息学、中药化学、分析化学、中药药理学、分子生物学等方法,研究补肾壮骨汤抗骨质疏松药效物质及作用机制。基于网络药理学、代谢组学结合分子对接技术筛选补肾壮骨汤抗骨质疏松的成分靶点,分析和鉴定活性组分中的主要化学成分组成,阐明该复方抗骨质疏松的物质基础及作用机制,为该复方进一步开发利用奠定基础。方法:1、补肾壮骨汤治疗骨质疏松的活性组分筛选体内采用泼尼松龙诱导斑马鱼骨质疏松模型,体外采用过氧化氢诱导TM3细胞肾阳虚模型和地塞米松诱导MC3T3-E1细胞骨质疏松模型,探讨补肾壮骨汤水煎液及各分离组分的抗骨质疏松活性,筛选补肾壮骨汤抗骨质疏松的活性组分。采用RRLC-Q/TOF-MS技术分析抗骨质疏松活性组分中的化学成分。2、基于组效相关筛选补肾壮骨汤抗骨质疏松的活性成分建立补肾壮骨汤水煎液和不同分离组分的指纹图谱,分别结合TM3细胞睾酮含量、MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶含量和斑马鱼椎体的荧光强度,应用偏最小二乘回归分析筛选补肾壮骨汤抗骨质疏松的活性成分。3、基于网络药理学与代谢组学结合分子对接技术筛选补肾壮骨汤抗骨质疏松活性成分补肾壮骨汤活性组分中经液质分析得到化学成分,通过Swiss Target Prediction数据库预测其成分靶点;通过Drug Bank、OMIM和TTD数据库以“性腺功能减退（Hypogonadism）、睾丸性腺功能减退症（Testicular hypogonadism）、骨形成（Osteogenesis）、成骨不全（Osteogenesis Imperfect）、骨质疏松症（Osteoporosis）”为关键词分别筛选“肾阳虚、骨形成、骨质疏松”三方面的疾病靶点。将成分靶点与疾病靶点交集后,以构建补肾壮骨汤抗骨质疏松关系网络并获得交集后的得到三类疾病对应的效应靶点,将其分别导入STRING数据库获得三类效应靶点蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络。基于~1H NMR代谢组学筛选补肾壮骨汤活性组分处理后的TM3细胞、MC3T3-E1细胞和斑马鱼的差异代谢产物,通过Metascape数据库分别预测三组差异代谢产物的代谢靶点,通过STRING数据库获得代谢靶点蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络。进而将三种效应靶点PPI网络和三种代谢靶点PPI网络分别进行对应交集,构建“化合物-效应靶点-PPI-代谢靶点-差异代谢物”网络,将筛选出的主要化合物和对应的效应靶点进行分子对接分析,将结合能优于对应靶点原配体的化合物与PLS筛选出的潜在活性成分合并去重,最终筛选出补肾壮骨汤抗骨质疏松的活性成分。4、补肾壮骨汤活性成分的提取、分离及活性验证采用膜分离技术分离得到补肾壮骨汤水煎液的<1 KDa分离组分,应用中压制备色谱和高效液相制备色谱分离<1 KDa组分中的单体成分,并应用紫外光谱（UV）、红外光谱（IR）、核磁波普（NMR）和质谱（MS）鉴定其结构。进而应用斑马鱼骨质疏松模型测定所得单体对斑马鱼椎体荧光强度的影响。5、补肾壮骨汤抗骨质疏松活性成分的分离、鉴定及活性验证应用中压液相色谱技术结合高效液相色谱技术将补肾壮骨汤活性组分进行分离、鉴定、制备,将得到的化合物进行斑马鱼的活性验证,采用钙黄绿素标记骨矿化,并用流式细胞仪检测其对MC3T3-E1细胞凋亡的影响。6、补肾壮骨汤活性组分抗骨质疏松的作用机制研究应用网络药理学、代谢组学结合分子对接技术构建补肾壮骨汤活性组分的“化合物-成分靶点-PPI靶点-代谢靶点-差异代谢物”网络,将成分靶点、PPI靶点、代谢靶点合并去重后提取得到网络中核心效应靶点,将核心效应靶点分别导入Metascape构建KEGG信号通路和Cytoscape预测其生物过程注释。使用Cyto NCA插件对网络节点的进行分析,得到补肾壮骨汤活性成分抗骨质疏松的关键蛋白,采用Western blot技术,检测补肾壮骨汤活性组分作用斑马鱼后关键蛋白的表达量,从蛋白水平阐释补肾壮骨汤抗骨质疏松作用机制。结果:1、在62.5μg/m L浓度下补肾壮骨汤膜分离组分A对氧化损伤模型TM3细胞的睾酮含量及细胞存活率的提升明显高于补肾壮骨汤水煎液组、上清组分D、沉淀组分C、膜分离组分B;在62.5μg/m L浓度下补肾壮骨汤膜分离组分A对骨质疏松模型MC3T3-E1细胞的碱性磷酸酶含量及细胞存活率的提升明显高于补肾壮骨汤水煎液组、上清组分D、沉淀组分C、膜分离组分B;在100μg/m L浓度下补肾壮骨汤膜分离组分A对骨质疏松模型斑马鱼脊椎矿化面积的提升明显高于补肾壮骨汤水煎液组、上清组分D、沉淀组分C、膜分离组分B,因此,确定补肾壮骨汤膜分离组分A为补肾壮骨汤抗骨质疏松活性组分。进而应用RRLC-Q/TOF-MS分析了补肾壮骨汤活性组分中的105个化学成分,其中主要包括淫羊藿苷等34个黄酮类化合物、E-芥子酸龙胆二糖苷等16个苯丙素类化合物、京尼平苷酸等13个萜类化合物、木兰碱等12个生物碱类化合物、原儿茶酸等9个酚酸类化合物。2、基于组效相关分别筛选得到6个促进TM3细胞睾酮合成的潜在活性成分,7个促进MC3T3-E1细胞骨形成的潜在活性成分,5个抗斑马鱼骨质疏松的潜在活性成分。将三者合并去重后筛选出7个补肾壮骨汤抗骨质疏松的潜在活性成分。3、基于网络药理学联合代谢组学分析,构建了由“73个化合物-9个成分靶点-12个PPI靶点-10个代谢靶点-6个差异代谢物”组成的补肾壮骨汤促TM3细胞睾酮合成网络;构建了由“47个化合物-5个成分靶点-5个PPI靶点-9个代谢靶点-6个差异代谢物”组成的补肾壮骨汤促MC3T3-E1细胞骨形成网络;构建了由“84个化合物-10个成分靶点-12个PPI靶点-15个代谢靶点-7个差异代谢物”组成的补肾壮骨汤抗斑马鱼骨质疏松网络。根据网络中化合物与成分靶点关系,采用分子对接技术进一步从促TM3细胞睾酮合成网络中筛选出结合能优于对应靶点原配体的潜在活性成分14个,从促MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶合成网络中筛选出结合能优于对应靶点原配体的潜在活性成分5个,从抗斑马鱼骨质疏松合成网络中筛选出结合能优于对应靶点原配体的潜在活性成分14个,将三者合并去重后,最终得到补肾壮骨汤抗骨质疏松活性潜在成分21个。4、将组效相关筛选的7个潜在活性成分与网络药理学、代谢组学结合分子对接技术筛选的21个潜在活性成分合并去重,共得到补肾壮骨汤27个潜在活性成分。采用中压制备色谱和高效液相制备色谱分离并鉴定9个单体化合物。并结合已有标准品应用斑马鱼骨质疏松模型测定了22个单体化合物的抗骨质疏松活性,结果表明,它们都能在不同程度上促进斑马鱼脊椎矿化,其中来自君药的橙皮苷、金丝桃苷,来自臣药的原儿茶酸,来自佐药的山奈酚对斑马鱼脊椎骨矿化明显高于对照组,表明以上单体化合物是补肾壮骨汤抗骨质疏松的主要活性成分。5、通过中压液相色谱技术结合高效液相色谱技术将补肾壮骨汤活性组分分离制备得到23个化合物,分别为焦性没食子酸（化合物1）、没食子酸（化合物2）、原儿茶酸（化合物3）、京尼平苷酸（化合物4）、原儿茶醛（化合物5）、木兰碱（化合物6）、咖啡酸（化合物7）、表儿茶素没食子酸酯（化合物8）、毛蕊花糖苷（化合物9）、木犀草苷（化合物10）、金丝桃苷（化合物11）、异槲皮素（化合物12）、柚皮苷（化合物13）、异鼠李素（化合物14）、芦丁（化合物15）、橙皮苷（化合物16）、根皮苷（化合物17）、圣草酚（化合物18）、槲皮素（化合物19）、山奈酚（化合物20）、芹菜素（化合物21）、淫羊藿苷（化合物22）、齐墩果酸（化合物23）。应用斑马鱼骨质疏松模型验证了38个单体化合物的活性,结合分子对接结合能<-5.0 k J/mol共筛选出焦性没食子酸、京尼平苷酸、原儿茶醛、咖啡酸、柚皮苷、金丝桃苷、异槲皮素、根皮苷、圣草酚、淫羊藿苷、异鼠李素、β-谷甾醇和羽扇豆醇13个化合物为补肾壮骨汤抗骨质疏松的优选活性组分。6、应用网络药理学、蛋白组学、代谢组学结合分子对接技术构建了由“84个化合物-10个成分靶点-12个PPI靶点-15个代谢靶点-7个差异代谢物”组成的补肾壮骨汤抗斑马鱼骨质疏松网络。将该网络中成分靶点、PPI靶点、代谢靶点合并去重后提取得到22个核心效应靶点。将22个核心效应靶点导入Metascape数据库,构建了甲状腺激素信号通路（thyroid hormone signaling pathway）等在内的6条KEGG信号通路,通过Cyto NCA插件对网络节点度值、介数的综合分析,最终得到补肾壮骨汤活性组分抗骨质疏松的关键蛋白BMP2。应用Western blot验证BMP2蛋白表达变化,与模型组相比,在100μg/m L和200μg/m L组中BMP2蛋白显著增加,其中100μg/m L组增加最多。因此,补肾壮骨汤活性组分可能通过激活甲状腺激素信号通路上调BMP2的表达,进而改善泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松症。结论:本研究通过RRLC-Q/TOF-MS表征了补肾壮骨汤中105个化学成分,借助中药组效学的方法筛选出其抗骨质疏松的主要活性成分13个优选活性组分,明确了药效物质基础。基于网络药理学、蛋白组学、代谢组学结合分子对接技术筛选得到补肾壮骨汤抗骨质疏松的关键靶点BMP2和甲状腺激素信号通路,进而应用分子生物学技术验证并阐明了其抗骨质疏松的分子作用机制。网络药理学研究多成分与多靶点协同调控,蛋白组学可知细胞中正在发生的变化行为、代谢组学强调生物体整体功能状态的生化表型,均与中医理论的整体观具有高度相似性,结合分子对接技术作为计算机虚拟高通量筛选方法具备快速简便的特点,本论文构建的研究体系为其他中药筛选机制明确的有效成分和具体分子机制研究提供了方法学上的参考。