西藏地处我国西南边疆,边境线漫长,与多个国家和地区接壤,处在鸟类迁徙路线上,是我国野生鸟类重要聚集地之一,已有多个国家和地区的野鸟中已经检测到禽流感病毒。藏鸡是分布地海拔最高的鸡种,对高海拔低氧、自由放养有较大的适应力,具有地方原始小型品种,2000年藏鸡列入了《国家品种资源保护名录》(陆仲磷等,2009),近年来,随着西藏农牧业产业结构的调整,藏鸡场集约化程度不断提高,藏鸡的养殖已经成为我区农牧民增收致富的重要途径之一。但由于缺乏全面、系统的鸡病防治技术,致使鸡的各种传染性疾病发病率很高,尤其是全球流感爆发和流行,给藏鸡养殖业带来很大的经济损失。这对西藏地区养禽业带来了严重的威胁。本研究是首次从西藏病死藏鸡中分离并鉴定H9N2亚型禽流感病毒和新城疫病毒,并对其进行了生物学特性研究,以期了解藏鸡禽流感病毒和新城疫病毒的遗传演化规律,应用比较蛋白质组学方法筛选NDV代表毒株感染鸡胚成纤维细胞后差异表达的蛋白,揭示出病毒与宿主细胞的相互作用,从分子水平上阐明NDV的致病机制,进而为西藏地区禽流感防控策略的制定提供依据。同时,为预防和控制藏鸡新城疫的暴发和流行奠定基础。1.禽流感H9N2亚型病毒西藏分离毒株的分离鉴定及全基因组遗传进化分析本研究内容主要是对3株H9N2亚型禽流感病毒西藏分离株进行全基因组测定与分析。根据GenBank登陆的H9N2亚型AIV全基因序列,设计了8对引物,RT-PCR方法获取了A/Chiken/Tibet/Sl/2009、A/duck/Tibet/S2/2009、A/Chiken/Tibet/S4/2009的8个基因序列,并对所得序列进行同源性及遗传进化分析。结果显示,HA基因裂解位点处均为RSSR/G,符合低致病性禽流感的特征；3株西藏分离毒株之间同源性为98%-99%；各分离毒的HA、NS和NA基因与亚欧分支A/Chiken/Beijing/1/94分支中的A/Duck/HongKong/Y280/97分支遗传距离最近,而M、NP、PA、PB1和PB2基因与欧亚分支中另一分支A/Quail/HongKong/Gl/97群系遗传关系近。2.新城疫病毒西藏分离株的生物学特性研究从西藏病死藏鸡中分离到具有血凝活性的病毒,经血凝抑制试验、PCR扩增和测序鉴定为NDV,动物感染试验证明该病毒对鸡具有致病性；毒株毒力测定结果显示：MDT为120h,EID50为10-8.44、IVPI为0.5、ICPI为0.6；血凝解脱及血凝素热稳定性试验显示：各分离株的血凝解脱时间短,血凝素热稳定性较差。F基因的序列测定遗传进化分析表明,西藏分离毒株之间的核苷酸序列具有99%的同源性,与疫苗株LaSota的同源性90%；与国内标准强毒株F48E8同源性为81%。其氨基酸序列分析表明,各分离株F蛋白的裂解位点氨基酸112G-K-Q-G-R-L117,具有NDV弱毒株特征。为了在细胞蛋白水平上研究西藏藏鸡NDV和宿主细胞之间的相互关系,本研究以感染了NDV的CEF为研究对象,采用双向凝胶电泳(2-DE)结合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定技术(MALDI-TOF-MS)的比较蛋白质组研究及Western blot试验,分析藏鸡NDV感染CEF后24h、48h与60h三个时间点细胞蛋白表达动态。CEF感染藏鸡NDV后,双向凝胶图谱的差异表达和分析显示,共有50个蛋白点表达差异显著,质谱成功鉴定了38个蛋白点,对应29种蛋白质或蛋白亚基,其中17个蛋白显著上调表达,12个蛋白点显著下调表达。新城疫病毒感染CEF细胞后,鉴定出了8个新城疫病毒磷蛋白(P)的蛋白质点。其中7个蛋白点(CJ02,cJ03,CJ05,CJ07,CJ08,CJ20,cJ23)的分子量相同,只有(CJ14)蛋白的等电点不同。本试验鉴定到的actin、αcardiac muscle 1 isoform 2、cytoskeletalβactin、VDAC-2发生上调,而βactin、keratin 18、cytokeratin 8、β-tubulin、HSP90和HSP27、calumenin都发生下调。另外,在试验中鉴定到多个不均一核内核蛋白(hnRNPs)表达发生改变,如hnRNP C发生下调,而hnRNP K的表达量升高。通过生物学软件构建的信号网络模型,发现差异表达的蛋白形成了以热休克蛋白和转录调节代谢蛋白为主的网络图。而一些差异蛋白能够与细胞的炎性反应调节因子和细胞的免疫调节相关蛋白相互作用,揭示了新城疫病毒感染CEF细胞后细胞内复杂的生物学变化。选取一些重要的节点蛋白与调节基因进行下一步研究,有助于进一步揭示新城疫病毒的致病机理。本论文首次对NDV西藏分离毒株遗传进化和生物学特性情况,为进一步研究高海拔、缺氧环境下新城疫病毒生物学特性变化研究奠定了基础。