肠出血性大肠埃希菌(EnterohemorrhagicEscherichiacoil，EHEC)O157：H7是一种重要的肠道病原菌。EHEC亦称为VERO毒素大肠埃希菌(verotoxigenicE.coli，VTEC)为出血性结肠炎和溶血性尿毒综合症的病原体。 EHEC的致病因子主要有菌毛和毒素。病菌进入消化道后，由紧密黏附素intimin介导与宿主末端回肠、盲肠和结肠上皮细胞结合，释放毒素，引起出血性腹泻。该毒素能使vero细胞产生病变，故称vero毒素，又因同志贺菌的毒素在生物学特性、物理特性和抗原性等方面相似，亦称志贺样毒素(shiga—liketoxin，SLT)，1982年Riley首次报道了EHECO157：H7引起的严重食源性疾病一出血性结肠炎。20多年来，世界各地包括中国都有不同规模的暴发流行，世界上许多国家如日本、加拿大、澳大利亚、德国、泰国等都发生过流行，EHEC主要引起散发性感染，也可引起爆发性流行，本病发病季节多见于夏秋季，7—8月份为发病高峰期，各年龄组人群普遍易感，但年老体弱者居多，无明显性别差异，传播途径主要是消化道，传染源为被EHECO157：H7污染的水或被感染的人(包括无症状的携带者)。1999-2000年，我国苏皖两省发生EHECO157：H7大规模暴发流行，患者两万多人，导致急性肾功能衰竭190多人，死亡177人。1996年5—8月，在日本东京、大阪、京都等相继发生了由O157：H7暴发感染，引起大规模的集体中毒事件，其流行范围广、发病人数多，引起全世界的广泛关注。2006年9月美国报道发生大肠杆菌O157：H7污染菠菜的案例，波及20多个州。 近年来大肠杆菌O157：H7的致病机制研究成为关注热点，EHECO157：H7感染可致腹泻、出血性结肠炎(hemorrhagiccolitis，HC)，还可引发溶血性尿毒综合征(hemolyticuremicsyndrome，HUS)及血栓性血小板减少紫癜(thromboticthrombocytopenicpurpura，TTP)等严重并发症，严重者可导致死亡。EHECO157：H7与宿主肠道粘膜上皮细胞的粘附是疾病发展的第一步。介导O157：H7粘附定植的主要结构单元是III型分泌系统(type—IIIsecretionsystem，TTSS)。III型分泌蛋白EspA(E.colisecretedprotein，EspA)在细菌表面形成针状扩展结构，这种结构是绕过细胞微绒毛和粘膜层必不可少的转移装置，它在细菌和宿主细胞之间架起一座桥梁，细菌外膜蛋白intimin及Tir蛋白被转移至宿主细胞。其他分泌蛋白EspA、B、D促使O157：H7紧密粘附至宿主细胞，引起肌动蛋白重排与聚集，导致宿主细胞发生病理改变，形成A/E(attaching/effacing)损伤。 研究EHEC的目的，为的是探讨其致病机理，探讨其与宿主细胞相互作用的机理，目前，已清楚其致病的基因有编码紧密黏附素intimin的eae基因。EHEC和宿主的相互作用是决定感染及发病的关键。 因为eae基因编码黏附素intimin蛋白众多文献已报道清楚，EHEC与宿主细胞黏附的过程中，intimin不仅在细菌粘附中发挥关键性的起动作用，也在形成A/E损伤的效应分子传递中起到桥梁作用，所以选择eae作为研究对象，克隆表达其编码的intimin蛋白，纯化intimin，为下一部研究打下基础，阐明O157的致病机理，寻找预防、控制和治疗O157感染的手段具有重要意义。 研究方法： 1.Eae基因的扩增：根据GenBank上公布的EHECO157：H7EDL933标准株基因序列，设计引物，以广州株为模板，通过PCR，扩增出eae基因。 2.构建eae—PMD19—T重组克隆载体：纯化PCR产物，eae基因片断与PMD19—T载体连接，转化感受态细胞，X—GAL，IPTG诱导，经阳性克隆筛选，PCR或酶切鉴定，再测序分析。 3.构建表达质粒载体：重组质粒经NdeI/XhoI双酶切后，eae基因与PET28a表达载体连接，再转化感受态工程BL21(DE3)，在含卡那霉素的培养基中筛选，提取质粒，经PCR或酶切鉴定。 4.蛋白表达：重组表达质粒被转化到BL21菌中，经IPTG诱导，诱导条件被优化后，稍离心菌液，取上清液加入上样缓冲液，煮沸5分钟，经SDS-PAGE检测所表达的蛋白intimin。 5.蛋白纯化：intimin蛋白经Ni+2柱纯化，经过纯化的蛋白经SDS-PAGE和Westernblot检测。 6.Intimin蛋白结构功能域生物信息学分析：利用生物信息学DNAstar5.0软件分析DNA序列，及其编码的蛋白特征，也可以利用哈佛大学在线软件，预测intimin蛋白抗原表位，并且利用DNAstar5.0生物信息学软件预测intimin可能的抗原性位点，亲水性位点，柔韧性位点。 研究结果： 1.获得了eae基因：利用Tiangen细菌基因组提取试剂盒提取的EHECO157：H7基因组，经凝胶电泳检测片断大小与标准DNAMarker相比对，并经过几次的提取，并验证是EHEC的基因组，设计引物，以基因组为模板，PCR扩增出了eae基因大小2805bp，经凝胶电泳比对分析是预期所要的片断。 2.构建了克隆载体：将PCR产物经过纯化，与克隆载体PMD19—T连接，转化感受态细胞JM109，经过阳性克隆筛选，提质粒，酶切测序鉴定，经凝胶电泳分析片断大小为5497bp(2805bp+2692bp)。 3.构建了表达载体：经过单双酶切，将eae基因片断，转化到PET28a表达载体，经过酶切测序鉴定已成功转化到表达载体中。 4.表达出intimin蛋白：Eae片断与PET28a载体的连接产物，再转化到BL21工程菌中，成功表达出intimin蛋白。纯化所表达出的intimin蛋白，进行生物活性分析。 5.生物信息软件预测了intimin的生物活性：利用生物信息学软件DNAstar5.0预测intimin蛋白的生物学性质，在220-330，615—710，氨基酸残基位点处，有好的抗原性，在202-210，510-520，716—735氨基酸残基位点间，有好的亲水性，在175-200，300-315，550-610，710-780氨基酸残基位点间，有好的柔韧性。 结论： 1.成功扩增EHECO157：H7广州株(EF079676)eae基因，基因全长2805bp，与GenBank标准株EDL933eae基因同源性为99.89％。 2.将eae基因克隆到PMD19—T载体上，经PCR及序列测定鉴定，证明成功构建重组质粒。 3.将eae基因连接PET28a表达载体，成功构建了重组表达质粒。 4.通过优化表达条件，使eae—PET28a在E.coliBL21中稳定高效表达intimin蛋白，分子量是94kDa，目的蛋白以包涵体形式表达。 5.通过以上方法，通过提取EHECO157：H7基因组，根据GenBank公布的序列，设计引物，成功扩增出eae基因，成功构建克隆重组质粒载体，并成功构建重组表达载体，并在BL21工程菌中表达出了目的蛋白intimin，为下一步的筛选intimin受体蛋白，打下了基础。