出血是急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)的一个显著的临床特征。在应用维甲酸及其衍生物诱导治疗APL时期,该病的无病生存率和总体生存率得到了显著改善,然而出血尤其是致死性重要脏器出血仍是该病患者早期死亡的主要原因。APL出血的机制复杂,近年研究认为,除了弥散性血管内凝血((disseminated intravascular coagulation,DIC)和继发性纤溶亢进外,由APL细胞自身表达、分泌的促纤溶蛋白引起的原发性纤溶亢进及蛋白裂解作用也是导致APL出血的重要因素。深入探讨导致APL原发性纤溶亢进的潜在机制将会为临床治疗提供可靠的理论依据。膜联蛋白Ⅱ(AnnexinⅡ,AnnⅡ)属于钙依赖性磷脂结合蛋白超家族,是组织型纤溶酶原激活剂(tissue type plasminogen activator, t-PA )和纤溶酶原的共受体,介导t-PA催化的纤溶酶生成;AnnⅡ广泛表达于机体多种细胞,包括肿瘤细胞、内皮细胞等。研究表明,APL细胞表面高表达AnnⅡ,APL细胞较其他低表达AnnⅡ的细胞能够更强的促进依赖t-PA的纤溶酶生成。这提示高表达AnnⅡ可能是APL细胞促纤溶活性增强的一个重要因素,而AnnⅡ的表达是否与APL患者体内纤溶活性相关未见报道。全反式维甲酸(ATRA)和亚砷酸(ATO)分别通过不同的机制诱导APL细胞向成熟分化或者凋亡最终使该病达到缓解,临床上使用这两种药物后患者的出血症状迅速得到改善。ATRA或ATO减轻APL出血的作用机制一直是人们研究的热点。早期研究表明,ATRA和ATO在体内外均可下调APL细胞组织因子(TF)和癌性促凝物质的表达,抑制其促凝活性,降低了DIC和出血的发生率。近几年体外试验结果表明,ATRA和ATO与APL细胞作用后,APL细胞AnnⅡ的表达下降,同时其促纤溶酶生成的能力也明显降低。这些结果提示诱导治疗可通过纠正APL细胞的促纤溶活性降低患者出血发生率。然而ATRA和ATO是否在体内具有同样的作用未见报道。本文选择初治APL36例,留取治疗前骨髓细胞,分别用流式细胞术和westernblotting检测APL细胞AnnⅡ蛋白的表达,real time-PCR检测APL细胞AnnⅡ的mRNA含量;发色底物法检测细胞的促纤溶活性,并与其他类型急性白血病64例比较,分析APL细胞促纤溶活性的改变及与AnnⅡ的表达有无关联。结果发现:①所有急性髓系白血病细胞均可检测到AnnⅡ抗原的表达,其中急性单核细胞白血病(M5)与APL细胞的表达最高,平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)分别为9.93±2.23(n=12)及9.79±2.44(n=12),二者之间无统计学差异; AML-M1、M2、M4细胞表面AnnⅡ的表达较低,平均荧光强度分别为: 3.19±0.56 (n=10)、3.38±0.76 (n=11)、3.05±0.68 ( n=10)。急性淋巴细胞白血病细胞表面AnnⅡ的表达与正常对照骨髓细胞比较无差异,其中ALL-B为1.12±0.65 ( n=10) , ALL-T为0.5±0.26 ( n=11)。Western blotting显示APL细胞及M5细胞裂解液上样区可见一大小约为36Kd的特异性条带,其灰度明显强于其他白血病细胞裂解液上样区。②发色底物法检测上述不同类型急性白血病细胞的促纤溶活性,APL细胞和M5细胞促进依赖t-PA的纤溶酶生成的能力最强,酶促速率常数K分别为0.011±0.001及0.010±0.002。M1, M2及M4细胞的K值分别为APL的34.4%, 40.6%及53.1%。采用抗AnnⅡ的单克隆抗体预先与APL细胞作用后,其促纤溶活性与和无关抗体作用后的APL细胞相比下降了36%。这提示高表达AnnⅡ可能是导致细胞膜表面纤溶酶生成增多的重要原因。为了进一步证实AnnⅡ在APL细胞促纤溶活性中的重要作用,我们构建了AnnⅡ基因真核表达质粒瞬时转染低表达AnnⅡ的HL-60细胞。首先以HUVEC提取的总RNA逆转的cDNA为模板,用PCR的方法扩增包含AnnⅡ开放阅读框全长的cDNA,扩增的PCR产物连接pMD?19-T载体,经DNA序列分析鉴定后与真核表达载体pcDNA3.1(-)连接,成功构建pcDNA3.1(-)-AnnⅡ真核表达载体后,采用电击穿孔法瞬时转染HL-60细胞。同时,采用针对AnnⅡ的特异性小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)转染NB4细胞,观察AnnⅡ基因表达上调或下调对早幼粒细胞促纤溶活性的影响。结果发现:①转染pcDNA3.1-AnnⅡ的HL-60细胞与转染空载体组相比,其促纤溶酶生成能力提高了约5.1倍(P<0.01)。②另外,与对照组相比,siRNA转染组APL细胞AnnⅡ的基因表达显著下降,同时其促进依赖t-PA的纤溶酶生成的能力也降低至对照组的58.4% (P<0.05)。这些结果表明, AnnⅡ表达上调可明显提高细胞膜表面的纤溶酶生成,而该蛋白表达下调则降低细胞膜表面纤溶酶的生成效率。采用ELISA及发色底物法检测上述30例具有明显出血倾向的初诊急性白血病治疗前血浆纤溶指标和凝血指标,并对APL患者按治疗方案分组,动态观察血浆纤溶指标及AnnⅡ在诱导治疗过程中的变化,结果发现:①急性白血病均存在纤溶激活,多数患者纤维蛋白原水平降低,FDP和D-二聚体增高;APL患者FDP(40.2±12.9mg/L)和D-二聚体(14.8±13.0 mg/L)的含量最高,纤维蛋白原水平降低(1.5±1.2g/L)。T-PA:A及t-PA:Ag在AL患者与正常对照无差别。而PAI-1:Ag在10例合并DIC的患者中增高。11例无合并DIC的APL患者中多数患者APTT (36.4±3.4 sec)和PT (15.2±2.1 sec)正常或轻度延长,AT活性正常,FDP增高,纤维蛋白原水平降低。但FDP和纤维蛋白原的含量与APL细胞的AnnⅡ表达量之间并无明显相关性。②1 8例APL患者经ATRA(n=9)或ATRA+ATO(n=9)诱导治疗后2-3周,血浆纤溶指标逐渐恢复正常,7例合并DIC的APL患者当DIC纠正之后PAI-1:Ag水平亦恢复到正常水平。达到血液学缓解时APL骨髓细胞表面AnnⅡ的表达下降(MFI=4.15±2.14),但仍高于正常对照(MFI=0.79±0.41),直至获得分子生物学缓解。提示PML/RARα融合基因可能参与调控AnnⅡ的表达,具体作用机制有待进一步研究。以上结果表明,APL存在原发性纤溶活性亢进,高表达AnnⅡ可明显增强早幼粒细胞体外纤溶酶生成的效率,但AnnⅡ的表达与APL患者体内纤溶活性的改变并不一致。AnnⅡ可能是导致APL原发性纤溶亢进的一个重要因素,但不是唯一决定因素。以全反式维甲酸和/或亚砷酸为基础的诱导治疗方案可通过下调AnnⅡ的表达纠正APL高纤溶活性,降低APL出血发生率。