背景骨折愈合是一个复杂的修复过程,骨折修复早期,损伤组织产生的生长因子促使未分化的间充质细胞在损伤部位聚集、增殖和分化,通过膜内和软骨内骨化最终完成骨折修复过程。膜内骨化是由骨祖细胞和未分化的间充质细胞向成骨细胞分化直接在骨内、外膜形成新骨。软骨内骨化期间,间充质细胞分化成软骨细胞,产生软骨基质,它经历钙化,直至最终被骨取代。最初形成的骨经过重塑和改建过程形成原来的形状和和生物力学特性。当骨折修复过程中受到一些有害因子的作用后,成骨细胞分化受到抑制,影响了骨折修复,最终导致骨折延迟愈合或不愈合,许多病人被迫需要甚至经历多次的手术治疗。另外,一些外科重建手术如脊柱融合或关节置换,如果骨向内生长受抑,将会导致融合失败或早期松动,许多患者不得不接受返修手术。在这些情况下,应用一些辅助药物可以有助于骨折的愈合,避免手术或提高了手术疗效。尽管骨折愈合的组织学和一般的机制目前已经比较清楚,但对骨折愈合过程中分子信号水平的理解还较少。胚胎骨骼发育过程中β-连环蛋白信号途径(它激活Tcf-依赖性转录)中的β-连环蛋白是一个关键性的调节剂。分泌Wnt配体和Wnt信号的拮抗物结合跨膜受体,包括低密度脂蛋白受体相关蛋白-5/6(Lrp5/6)和Frizzled(Fz)调节Wnt途径。Wnt信号的激活产生细胞浆内一系列反应,导致基因表达的转录调节。缺乏合适的Wnt配体的情况下,糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)与APC和Axin组成的“破坏复合体”,使β-连环蛋白被泛素化降解。合适的Wnt配体存在的情况下,多蛋白复合体不降解β-连环蛋白,β-连环蛋白进入细胞核内,和T-细胞因子/淋巴增强因子(Tcf/Lef)家族共同激活了基因的转录。胚胎成骨形成过程中β-连环蛋白信号的抑制阻断了成骨细胞分化和使多分化潜能的间充质细胞向成软骨细胞分化。β-连环蛋白也调节骨量,它的激活导致骨密度的增加。最近有研究发现,骨折愈合期间局部可表达一些Wnt蛋白。口服锂治疗激活β-连环蛋白信号可增加了皮肤伤口愈合的尺寸。是否β-连环蛋白在骨折愈合期间也象胚胎骨骼发育过程一样发挥作用目前尚未见相关报道。本研究目的旨在调查β-连环蛋白在骨折愈合期间发挥何种作用,以期可能发现一个新的治疗途径应用它去改善骨折的愈合。目的1.观察β-连环蛋白在骨折愈合期间变化规律,β-连环蛋白的变化对其介导的Tcf/Lef依赖性基因转录调节发挥何种作用及其对骨折愈合产生的影响。2.在细胞分子水平探讨其在骨折愈合期间发挥信号传导的作用机制,为发现一个新的治疗途径应用它去改善骨折愈合提供实验理论依据。方法1.应用Hiltunen描述的方法制作Tcf报道鼠的胫骨骨折模型,随机分为三组:I组-对照组;II组-骨折组;III组-Dkk-1注射组。术后不同时间点随机选择一定数量的动物处死,获取局部的骨痂标本,应用Faxitron MX20X-ray系统行X线检查后,置于-70℃深低温冰箱中备用。每个时间点至少处死3只鼠进行研究。2.应用ECL辣根过氧化酶(HRP)-共轭抗体作为选择抗体对骨折愈合不同时间点β-连环蛋白水平进行Western blot分析。使用AlphaEaseFC软件(Alpha Innotech)进行密度测定对表达水平进行相对定量。3.应用β-半乳糖苷酶染色试剂盒对不同时间点的骨痂组织切片进行β-半乳糖苷酶染色,对β-连环蛋白介导的Tcf依赖性基因转录进行细胞内定位,了解β-连环蛋白水平与β-半乳糖苷酶染色阳性信号之间的关系。4.应用RT-PCR技术检测骨折愈合期间wnts和它们受体的表达,探讨β-连环蛋白在骨折愈合过程中的信号传导是否受到Wnt的直接调节。5.将Ad-Dkk1(Dkk-1为β-连环蛋白信号传导拮抗剂)注射到骨折部位,通过影像学、组织形态学测量等方法观察β-连环蛋白信号传导拮抗剂Dkk-1对骨折愈合的影响。结果1.应用Western分析对Tcf报道鼠不同时期骨痂的β-连环蛋白进行了测定,发现在完整的骨组织中β-连环蛋白水平低,在整个骨折愈合期间呈现高表达。骨折后3周,Dkk-1腺病毒处理的骨痂样本显示β-连环蛋白水平低于未用Dkk1的骨痂样本,二者比较差异有统计学意义(P<0.01),显示骨折愈合期间β-连环蛋白被激活。2.骨折愈合期间不同时间点的β-半乳糖苷酶染色发现,骨折后3天未分化的梭形间充质细胞阳性染色少见。骨折后1周软骨基质周围软骨形成前的间充质样细胞,和骨外膜内成骨细胞,出现阳性染色。骨折后2周,增殖中或肥厚前的软骨细胞可检测到阳性染色,肥厚软骨细胞没有显示染色,沿着骨外膜或编织骨骨岛的成骨细胞显示强的阳性信号。骨折3周后随着成骨细胞向骨细胞分化成熟染色强度逐渐变弱,阳性染色在成骨细胞可检测到,在分化完成的骨细胞染色水平低。以上发现提示β-连环蛋白介导了Tcf/Lef依赖性基因转录。3.应用RT-PCR检查了骨痂Wnts和它们受体的表达。发现Wnt-4、Wnt5b以及受体Fz-1和Lrp-6在骨折愈合期间呈高表达。因为Wnt4、Wnt5b能够调节规范的信号途径,因此,这些Wnts配体和受体可能与骨折修复期间β-连环蛋白激活有关。4.通过影像学观察发现,骨折术后第3周,所有II组骨折动物显示完全愈合,而Dkk-1处理组愈合失败。组织切片HE染色和组织形态学测量发现,Ad-Dkk1处理组骨痂切片诸参数测量(软骨和骨组织占整个骨痂组织量的比例,小梁骨的直径(μm),数量(每毫米))数值均低于对照组,II组小梁骨的间隔(μm)明显短于Ad-Dkk-1处理组,二者比较差异有统计学意义(P<0.O1),显示β-连环蛋白信号传导拮抗剂Dkk-1抑制骨折愈合中的软骨和骨形成。进一步证实了β-连环蛋白信号在骨折愈合中发挥了关键作用。结论骨折愈合过程中许多Wnt配体和受体出现增量调节,它们激活了Wnt/β-连环蛋白信号途径;愈合过程中β-连环蛋白出现高水平的表达,β-连环蛋白介导了主要针对增殖中的软骨细胞、肥厚前的软骨细胞和成骨细胞的Tcf依赖性基因转录,促进了骨折愈合;β-连环蛋白信号传导拮抗剂Dkk-1抑制骨折愈合中的软骨形成和骨形成,进一步说明β-连环蛋白在骨折愈合中可能发挥关键作用。本研究说明激活β-连环蛋白的治疗措施可能有助于骨折的愈合,本实验为促进骨折愈合提供了一个新的治疗途径。其机制是:骨折愈合期间Wnt配体和受体出现增量调节,它们激活了Wnt/β-连环蛋白信号途径,β-连环蛋白高水平的表达,β-连环蛋白介导了主要针对增殖中的软骨细胞、肥厚前的软骨细胞和成骨细胞的Tcf依赖性转录,促进了骨折愈合。