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目的:Bcl-2/腺病毒E1B19kDa结合蛋白3(BNIP3)是Bcl-2蛋白家族BH3-only亚家族的非典型成员,尽管研究表明BNIP3作为缺氧诱导因子的靶基因在多种疾病过程中承担着重要的角色,比如心肌缺血,细胞自噬,细胞凋亡,但是关于BNIP3功能不同的研究往往得出相互矛盾的结果。本实验旨在探讨BNIP3在胰腺癌组织标本中的表达及其临床意义,研究BNIP3在胰腺癌细胞株中的表达及其调控胰腺癌细胞凋亡的作用和机制。方法:(1)利用免疫荧光(IF)及免疫组织化学法(IHC)检测BNIP3在70对胰腺癌组织和相应癌旁组织中的定位及表达,并分析BNIP3的表达与临床病理因素、其他凋亡相关蛋白及肿瘤凋亡及增殖的关系;(2)利用逆转录聚合酶联反应(RT-PCR)和Western blot检测BNIP3在胰腺癌细胞株PANC-1,Bx Pc-3,CaPan-1,SW1990、CFPAC-1、Patu-8988中的表达情况,分别用siRNA-BNIP3转染胰腺癌细胞株靶向沉默BNIP3的表达,用BNIP3全基因质粒载体转染胰腺癌细胞株上调其表达,利用RT-PCR和Western blot确认RNAi靶向沉默及质粒过表达BNIP3的效果;(3)沉默BNIP3及上调其表达后,利用细胞凋亡检测、线粒体膜电位检测,细胞活性氧检测,Western blot检测凋亡相关蛋白的表达,研究BNIP3调控胰腺癌细胞凋亡的作用及机制;(4)利用甲基化PCR检测6株胰腺癌细胞的甲基化状态,去甲基化药物处理细胞,分析BNIP3甲基化和其表达的相关性;(5)利用CHIP实验分析BNIP3甲基化对缺氧诱导因子和其启动子区结合的影响。结果:(1)BNIP3在胰腺癌组织中的阳性率明显低于癌旁组织,且两者的差异有统计学意义(χ2=19.457,P<0.001),两者阳性表达率分别为35.7%和72.9%;BNIP3的表达与临床病理因素的分析结果显示,BNIP3的低表达与肿瘤大小、肿瘤分期及淋巴结转移密切相关,差异有统计学意义(P<0.05),而与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤分级无明显相关,差异无统计学意义(P>0.05)。胰腺癌组织中BNIP3的表达和促凋亡蛋白表达Bax正相关,和抑凋亡蛋白Bcl-2表达负相关,其低表达与肿瘤细胞增殖活跃、凋亡减少有关;(2)RT-PCR和Western blot检测结果显示,常氧条件下BNIP3的mRNA和蛋白水平在六株胰腺癌细胞株中除一株低表达外,其余的5株均表达沉默,且缺氧条件培养并未诱导其表达。(3)通过上调及下调BNIP3表达发现BNIP3可以调控线粒体途径相关凋亡蛋白的表达,和诱导细胞活性氧的产生、线粒体膜电位的下降及细胞凋亡。(4)甲基化PCR检测证实BNIP3启动子区的高甲基化和其在胰腺癌中的低表达密切相关,BNIP3启动子区的甲基化影响了缺氧诱导因子HIF-1α和其启动子区缺氧反应元件的结合。结论:BNIP3在胰腺癌组织中低表达,BNIP3的低表达与肿瘤大小、肿瘤分期、淋巴结转移密切相关。在体外实验中BNIP3启动子区的高甲基化抑制了HIF-1α和BNIP3的结合并使其表达沉默,进而为胰腺癌细胞逃避BNIP3诱导的线粒体途径促进细胞凋亡作用提供了条件。由实验结果可以推断,恢复胰腺癌中BNIP3的表达则可以增强肿瘤细胞对缺氧诱导凋亡的敏感性,有望成为潜在的治疗靶点。