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黄荆子为马鞭草科牡荆属植物黄荆Vitex negundo L.的干燥成熟果实。具有祛风除湿,行气止痛的功效,在民间多用于治疗类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)等疾病,疗效显著。目前,对于黄荆子在抗炎镇痛、抗肿瘤等方面的研究较多,而有关其抗RA的药效物质基础和作用机制鲜见报导,有关方面的研究工作亟待加强,为黄荆子的充分开发利用提供基础。因此,本研究对黄荆子进行活性部位和活性成分的跟踪筛选,以阐明其抗RA的作用机制。采用佐剂性关节炎(adjuvant arthritis, AA)大鼠模型,以关节炎指数、大鼠体重增长、足肿胀、免疫器官指数、外周血液单核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)中环氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)和5-脂加氧合酶(5-lipoxygenase,5-LOX)表达水平及大鼠血清中关键性炎症因子的表达为指标,观察黄荆子总提物(the extract of Vitex negundo seeds, EVN S)体内抗类风湿性关节炎的作用。结果表明,黄荆子总提物能显著性降低关节炎指数,改善AA大鼠足肿胀情况,提高AA大鼠体重增长速度；EVNS能减轻AA大鼠胸腺肿大,下调AA大鼠外周血液单核细胞中5-LOX和COX-2表达水平；EVNS能下调肿瘤坏死因子α (tumor necrosis fector-α, TNF-α)和白介素1β(interleukinlβ.IL-1β)和白介素6(interleukin6, IL-6)水平,上调白介素10(inter leukin10, IL-10)水平。从踝关节组织病理学变化中我们也可以看见,EVNS能改善关节组织的破坏情况,减少滑膜增生及炎性细胞浸润的现象。这些结果提示EVNS能通过免疫调节改善RA发病过程中的炎症损伤,并且维持细胞因子网络相对平衡,改善关节软骨破坏,从而缓解AA大鼠关节炎的症状。基于以上研究,我们推测,EVNS发挥抗RA作用可通过抑制炎症损伤和改善关节骨质破坏这两条途径共同起效。采用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激的RAW264.7细胞模型,以细胞上清液中一氧化氮(nitric oxide, NO)水平为指标,观察比较了黄荆子木脂素类单体(VEL)主要成分6-羟基-4β-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3a-羟甲基-7-甲氧基-3,4-二氢-2-萘醛,[6-Hydroxy-4β-(4-hydro xy-3-methoxyphenyl)-3a-hydroxymethyl-7-methoxy-3,4-dihydro-2-naphthaldehyde](VEL-Ⅰ), Vitedoin A (VEL-Ⅱ),黄荆子碱A (Vitedoamine A)(VEL-Ⅲ),黄荆子素A (Vitexdoin A)(VEL-Ⅳ), Vitrofolal F (VEL-Ⅴ)及萜类单体(VET)主要成分齐墩果酸(Oleanolic acid)(VET-Ⅰ), Negundol (VET-Ⅱ),牡荆内酯(Vitexilactone)(VET-Ⅲ),熊果酸(Ursolie acid)(VET-Ⅳ)对LPS刺激的RAW264.7细胞的作用。结果表明,除VEL-Ⅱ外,黄荆子活性化合物在浓度为40、20、10μg/ml时可明显降低RWA264.7细胞上清液中NO水平,且成剂量效应关系,提示黄荆子活性化合物具有良好的抗炎效果。综合分析,木脂素类单体成分抑制LPS刺激的RAW264.7细胞上清液中NO的效果更好。因此,采用LPS刺激的RAW264.7细胞模型,以细胞上清液中TNF-α和IL-1β水平为指标,观察比较了抑制NO效果较好的黄荆子木脂素类单体主要成分对LPS刺激的RAW264.7细胞产生TNF-α和IL-1β水平的影响。结果显示,所选黄荆子木脂素类单体主要成分在所测定的浓度范围内均能显著性降低模型细胞上清液中TNF-α和IL-1β水平,提示黄荆子木脂素类化合物是黄荆子在发挥抗RA作用中抑制炎症损伤的主要活性成分。采用成骨样细胞UMR106为模型,以成骨细胞增殖和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性为指标,观察比较了黄荆子5个木脂素类单体主要成分及4个萜类单体主要成分对成骨样细胞UMR106的作用。结果显示,木脂素化合物VEL-Ⅱ、萜类化合物VET-Ⅲ及VET-IV对成骨样细胞UMR106增殖和ALP酶活性均有促进作用。以骨髓单核细胞经1,25-(OH)2-VD3和地塞米松共同诱导而得到的破骨细胞为模型,以抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)为指标,观察比较了黄荆子5个木脂素类单体主要成分及4个萜类单体主要成分对破骨细胞的作用。结果表明,木脂素类化合物VEL-V、萜类化合物VET-Ⅲ及VET-IV在特定的浓度下能够显著的抑制TRAP的活性。应用Western-blot技术对炎症过程中的关键性蛋白COX-2, iNOS和核因子κB (nuclear factor kappa B, NF-κB) p65表达水平进行研究,发现木脂素化合物VEL-I及萜类化合物VET-Ⅱ, VET-Ⅲ能显著降低iNOS和COX-2的蛋白表达量。其他化合物则表现出选择性抑制,VEL-Ⅲ、VEL-Ⅴ能显著降低iNOS的蛋白表达量而萜类化合物VET-Ⅰ选择性降低COX-2的蛋白表达量。木脂素类化合物VEL-Ⅰ, VEL-Ⅲ, VEL-Ⅴ及萜类化合物VET-Ⅱ, VET-Ⅲ均能显著性抑制NF-κB p65蛋白表达。应用Western-blot技术对骨形成过程中的关键调控系统骨保护素(osteoprotegerin, OPG)/核刺激因子受体的配体(receptor for activation of nuclear factor kappa B ligand, RANKL)进行研究,发现木脂素化合物VEL-Ⅱ及萜类化合物VET-Ⅳ能显著上调OPG/RANKL比值；在对破骨细胞RANK信号转导系统的研究中,我们发现黄荆子木脂素化合物VEL-Ⅴ和萜类化合物VET-Ⅳ均能不同程度的下调破骨细胞磷酸化c-Jun氨基末端激酶(c-Jun terminal kinases, JNK)、磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶(extracellularsignal-regulated kinase, ERK)、P-P38和P-IκB的表达。采用AA大鼠模型,以关节炎指数、大鼠体重增长、足肿胀、免疫器官指数、PBMC中COX-2和5-LOX表达水平及大鼠血清中关键性炎症因子的表达为指标,观察VEL体内抗类风湿性关节炎的作用。结果表明,VEL能显著性降低关节炎指数和AA大鼠的足肿胀程度,改善由于造模引起的大鼠体重下降的情况且呈剂量依赖关系；VEL能剂量依赖性地显著性改善大鼠免疫器官(脾脏和胸腺)肿大,抑制COX-2和5-LOX两种酶的异常表达；VEL能剂量依赖性降低AA大鼠血清中IL-1β水平并显著性提高AA大鼠血清中IL-10水平,高剂量VEL(340mg/kg)能显著性降低AA大鼠血清中TNF-α、IL-6水平。踝关节组织病理学变化中我们也可以看见,VEL能改善关节组织的破坏情况,减少滑膜增生及炎性细胞浸润的现象。综上研究,本课题明确了黄荆子两大类活性成分—木脂素类活性成分及萜类活性成分—均可通过抑制RA发病过程中的炎症损伤和改善关节骨质破坏两条途径发挥其抗RA作用。