目的:组织工程气管为长段气管重建提供了良好的修复材料,极大程度改善了长段气管缺损（或狭窄）患者的预后,提高了术后生活质量。但目前基于静电纺丝和间充质干细胞的组织工程气管存在诸多问题,构建过程耗时长,常用的含有TGF-β3的软骨诱导体系效率低,所得软骨细胞表型不稳定。在本研究中我们将小分子化合物Karotogenin（KGN）预处理与TGF-β3常规诱导进行结合,以提高间充质干细胞成软骨分化的效率,维持所得软骨细胞的表型稳定及避免骨化,并在阐明KGN预处理与TGF-β3协同作用机制的基础上,将TGF-β3负载于静电纺支架材料中,从改良成软骨诱导体系和改进支架材料两个方面优化组织工程气管的构建流程。方法:采用组织块贴壁法从脐带组织中分离间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs）,通过流式细胞术鉴定细胞表面特异性标志物。KGN预处理不同时间后,通过CCK-8、Annexin/PI等方法检测细胞的增殖能力及凋亡水平;通过Western blotting检测软骨前体干细胞标志物的表达水平。KGN预处理UCMSCs 3天,之后再使用含有TGF-β3的常规成软骨培养液进行诱导28天。诱导完成后,通过免疫组化和RT-PCR检测细胞中成软骨/骨化相关基因的表达情况;通过磷酸激酶检测试剂盒筛选KGN预处理前后,磷酸化水平发生显著改变的蛋白质,并通过应用相应的阻断剂和激活剂进行体外/体内验证。通过同轴静电纺丝技术将TGF-β3负载于“壳芯结构”的纳米静电纺材料中,通过扫描电子显微镜、透射电子显微镜、激光共聚焦显微镜检测静电纺支架材料的表面特性、结构稳定性,通过拉伸法检测不同材料的力学特性,通过亲水角测试检测不同材料的亲水性,通过ELISA法检测不同构成比支架材料的缓释特性,通过CCK-8法和细胞骨架免疫荧光检测不同材料的生物相容性。确定最适构成比后,采用“三明治法”将KGN预处理的UCMSCs和负载TGF-β3的纳米电纺膜构建形成细胞-支架复合物,再将之包埋于裸鼠皮下体内成熟,取材后通过兔气管局部缺损修复实验,评价新型组织工程气管的应用潜能。结果:体外实验证实:KGN预处理后细胞的凋亡水平未明显上升;随着预处理时间的延长,细胞增殖能力逐渐下降,预处理4天时细胞增殖能力明显下降;此外,KGN预处理3天时,UCMSCs开始表达软骨前体干细胞标志物FGFR-3。经KGN预处理3天的UCMSCs能够在TGF-β3的诱导下向成熟透明软骨细胞分化;并且,与单纯经由TGF-β3诱导所得的软骨细胞相比,经KGN预处理后,UCMSCs分化而成的软骨细胞表达更高的成软骨基因,同时骨化相关基因的表达水平被抑制。磷酸化激酶筛选实验发现:KGN预处理对TGF-β3介导的干细胞成软骨分化的促进作用可能与上调JNK的磷酸化及抑制β-catenin的总蛋白水平直接相关。JNK阻断剂SP600125和（或）β-catenin激动剂SKL2001进行阻断/激动功能实验结果发现:KGN预处理促进TGF-β3介导的软骨分化的作用通过激活JNK/RUNX1通路实现,而其阻抑骨化的作用与抑制β-catenin/RUNX2密切相关。不同构成比的电纺材料均具有稳定的“壳芯结构”和较好的生物相容性,并能缓释TGF-β3,其中PLCL/Collagen为75/25的电纺材料具有最合适的力学特性及缓释行为。由KGN预处理的UCMSCs和负载TGF-β3的电纺材料构建的组织工程气管,能够成功用于兔气管局部缺损修复,且软骨细胞表型稳定,术后能够实现再上皮化,恢复气管的结构和功能完整性,同时构建时间大为缩短。结论:KGN预处理能够诱导间充质干细胞进入软骨前体干细胞阶段,此阶段的干细胞具有增强的JNK磷酸化水平和降低的β-catenin水平,能够在TGF-β3的诱导下向软骨细胞稳定分化,并且所形成的软骨组织骨化倾向被抑制。进一步应用KGN预处理的间充质干细胞和负载TGF-β3的PLCL/collagen纳米静电纺支架材料可快速构建组织工程气管补片,并成功用于兔气管局部缺损的修复。