前言在生物医学研究领域,随着高灵敏度和高特异性探针技术的不断发展,有机荧光染料应用存在的局限性越来越明显,量子点则在很多方面具有显著的优越性。量子点（quantum dots,QDs）是指半径小于或接近激子波尔半径的半导体纳米晶粒,粒径通常为1-10nm,一般为由第二族和第六族元素（CdTe,CdSe）,或第三族和第五族元素（InP,InAs）构成的化合物。作为一种新型荧光染料,具有诸多独特而优良的光学特性——连续而宽的激发光谱,且荧光谱峰位置可通过改变QDs的粒径进行调控,便于进行多元荧光检测;发射光谱窄,可同时显现多种不同颜色而无重叠;Stokes位移大,能够避免发射谱与激发谱重叠,从而允许在低信号强度的情况下进行光谱学检测;抗光漂白能力强,而这种抗光漂白的高度光稳定性对于需要长时间成像的研究而言极为重要;光稳定性高,便于获得无背景干扰的荧光信号等优良的光物理特性;荧光产率高,强度强,单一量子点表现出的荧光亮度是有机荧光染料的10-20倍。因此,量子点在多个研究领域显示出其广泛的应用前景。将量子点标记在抗体上制备免疫荧光探针,可特异性地识别细胞受体,进行细胞抗原的特异性检测。由于量子点独特的光学特性,将其标记抗体,引入免疫荧光成像研究,大大提高了特异性检测的灵敏度,且适用于多色成像与实时监测,这对生物医学的研究,尤其对高效进行肿瘤的早期检测具有重要意义。根据合成量子点时所采用溶剂的不同,高质量量子点合成方法主要可归结为两大类,一种方法是在高沸点的有机溶剂中利用前躯体热分解来合成,另一种是利用稳定剂在水溶液中直接合成。水相合成量子点本身具有水溶性与生物相容性,无需进行进一步的水溶性修饰即可直接与生物分子偶联。因此,本研究采用水相合成方法以制备巯基乙酸包被的CdTe量子点。大肠癌是发病率最高的恶性肿瘤之一,在我国已位居第3位,建立有效的早期检测的方法,以实现早期诊断、早期治疗是提高患者生存率的关键。ND-1是以人大肠癌细胞系CCL187为免疫原制备的鼠抗人大肠癌单克隆抗体,己进行的近千例临床病理检测显示,该单抗对高中分化大肠癌组织具有特异性结合活性,并优于目前广泛采用的美国商业产品抗CEA单抗。其所识别的大肠癌肿瘤相关LEA（large external antigen,LEA）位于细胞膜表面,是一种与细胞分化、侵袭能力相关的肿瘤抗原,在正常组织、非大肠癌及低分化大肠癌组织中,几乎不表达或表达率很低,在中高分化大肠癌组织中高度表达,对其检测有助于大肠癌的早期诊断,并可作为大肠癌恶性程度判断的参考指标。为此,本研究采用水相合成方法制备CdTe量子点,并将其与单克隆抗体ND-1偶联,制备大肠癌细胞相关抗原LEA的特异性荧光探针,实现对大肠癌细胞的高灵敏度检测,为大肠癌的早期诊断及成像研究提供新的方法和途径。材料与方法一、水溶性CdTe量子点的制备、纯化及表征1、水溶性CdTe量子点的制备在0℃无氧条件下合成NaHTe前躯体,以前躯体为核心合成量子点溶液,并在140℃条件下加热不同时间以获得不同粒度的量子点。2、水溶性CdTe量子点的纯化上述反应制得的量子点以0.22μm微孔滤膜过滤,以去除未反应完全的碲粉。超滤管离心超滤,以去除量子点溶液中过量的巯基乙酸。3、水溶性CdTe量子点的表征对量子点的紫外可见吸收光谱及荧光光谱进行检测,并根据荧光光谱谱峰估算出量子点的粒径;对140℃加热195min制备的QD₆13进行TEM检测。二、单克隆抗体的制备、纯化与鉴定1、单克隆抗体BALB/C小鼠腹水的制备雌性BALB/C小鼠腹腔内接种分泌ND-1的杂交瘤细胞株IC——2,每只小鼠注射0.5ml,细胞浓度为1-2×10⁶/ml,10-20日后陆续于腹腔抽取腹水。2、小鼠腹水的分离与纯化腹水中加入CaCl₂及离心去除蛋白纤维凝块,24h透析后经过HiTrap protein G柱亲和层析纯化单克隆抗体。纯化后抗体经超滤调整至适宜温度及置换缓冲液为PBS,4℃备用或-70℃长期保存。SDS-PAGE鉴定单克隆抗体纯度。Bradford法测定蛋白质含量。3、单克隆抗体免疫活性的检测以纯化的单克隆抗体为一抗,羊抗小鼠FITC-IgG为二抗分别孵育CCL87细胞和HeLa细胞,进行免疫荧光成像,以检测单克隆抗体ND-1的免疫活性。三、量子点与单克隆抗体偶联产物（QD₆13-ND-1）的制备与纯化1、量子点与单克隆抗体ND-1的偶联采用不同的缓冲体系对量子点表面羧基的偶联活化条件进行考察。采用EDAC连接法,使量子点QD₆13的巯基乙酸羧基基团-COOH与单克隆抗体ND-1末端的伯胺-NH₂共价反应。2、偶联产物QD₆13-ND-1的纯化采用Sephacryl S-200凝胶进行凝胶过滤层析,对量子点与单克隆抗体ND-1的偶联产物QD₆13-ND-1进行分离纯化。四、QD₆13-ND-1对大肠癌细胞的特异性免疫荧光成像（1）以水溶性CdTe量子点与单克隆抗体ND-1偶联产物QD₆13-ND-1为荧光探针,对特异性高表达LEA的大肠癌细胞CCL187进行特异性免疫荧光成像,分别以未偶联抗体ND-1的CdTe量子点QD₆13孵育CCL187细胞,及QD₆13-ND-1荧光探针孵育LEA表达阴性的HeLa细胞作为对照组。（2）QD₆13-ND-1与ND-1的竞争性抑制实验。分别以不同浓度单克隆抗体ND-1室温孵育CCL187细胞1h,再以QD₆13-ND-1孵育1h,观察荧光强度变化。五、CdTe量子点的抗漂白能力研究以488nm激发光持续激发QD₆13和FITC为荧光标记的CCL187细胞,共聚焦显微镜以285s为间隔自动连续采集图象,每个样品共采集图象12幅。在QD₆13与FITC荧光图像上,各选取2个ROI（兴趣区）,以Carl Zeiss LSM510激光共聚焦显微镜自带软件MeanROI分析2个区域的平均荧光强度。六、PEG修饰量子点降低非特异性吸附为降低量子点对细胞表面的非特异性吸附,采用NH₂-PEG对量子点进行修饰。以PEG修饰于水溶性CdTe量子点QD₆13表面,分别以PEG-QD₆13和QD₆13孵育CCL187细胞及HeLa细胞30min,研究PEG对CdTe量子点对细胞的非特异性吸附的去除作用。实验结果一、水溶性CdTe量子点的制备、纯化与表征1、合成巯基乙酸稳定的水溶性CdTe量子点140℃条件下加热75min,95min,115min,135min,155min,175min及195min,获得了在紫外光激发下荧光颜色从绿色渐变至黄色、橙色和红色的CdTe量子点。随着加热时间的增加,量子点不断生长增大,发射峰位红移,表现出明显的量子尺寸效应。2、CdTe量子点的紫外可见吸收光谱的检测随着制备中加热时间的增加,吸收光谱发生红移,获得不同粒径不同颜色荧光的CdTe量子点;每种量子点吸收峰明显,粒度均匀;吸收光谱不是单吸收峰,而是宽范围的吸收谱,有助于一元激发,多元发射——以一种激发波长实现多色成像。3、CdTe量子点的荧光光谱的检测随着制备中加热时间的增加,发射光谱谱发生红移;发射峰对称,最大半峰宽均在35-55nm之间,表现出较窄的尺寸分布。4、透射电子显微镜的检测合成的量子点为球形,粒径分布较均匀,平均粒径为3.93士0.14nm,与根据估算公式计算出的量子点粒径基本一致。注:红色荧光量子点QD₆13是加热不同时间合成的各种量子点中颜色与细胞背景荧光对比最鲜明的量子点,且其激发与发射光谱特征优良,故在后续的研究中均采用这种量子点。二、单克隆抗体的制备、纯化与鉴定1、单克隆抗体ND-1的纯化被纯化的单抗SDS-PAGE上呈现均一的两条带:一条为55kDa,另一条为25kDa,分别为IgG抗体的重链与轻链。凝胶成像扫描显示其纯度达到95%。2、单克隆抗体ND-1免疫活性的检测采用免疫荧光方法,以单克隆抗体ND-1作为一抗,羊抗小鼠FITC-IgG作为二抗孵育LEA阳性CCL187细胞,在CCL187细胞表面呈现明显的荧光信号;以PBS代替单克隆抗体ND-1作为一抗,FITC标记的抗小鼠IgG作为二抗孵育CCL187细胞,以及以单克隆抗体作为一抗,FITC标记的抗小鼠IgG作为二抗孵育LEA表达阴性的HeLa细胞,均无特异性结合荧光信号,以上结果证明纯化的单克隆抗体ND-1具有免疫学活性。三、量子点荧光探针QD₆13-ND-1的制备与纯化1、量子点荧光探针QD₆13ND-1的制备采用EDAC连接法,使量子点QD₆13的巯基乙酸羧基基团-COOH与单克隆抗体ND-1末端的伯胺-NH₂共价反应。选择了以pH7.4 PBS作为活化缓冲液。2、量子点荧光探针QD₆13-ND-1的鉴定与纯化采用Sephacryl S-200凝胶进行凝胶过滤层析,对量子点与单克隆抗体ND-1的有效偶联进行了鉴定,对偶联产物QD₆13-ND-1进行了初步的分离纯化。四、QD₆13-ND-1探针对大肠癌细胞的特异性免疫荧光成像1、QD₆13-ND-1对大肠癌细胞的特异性免疫荧光成像采用免疫荧光方法,QD₆13-ND-1对CCL187细胞表面显示特异性的荧光信号;QD₆13-ND-1对HeLa细胞,及QD₆13对CCL187细胞,细胞膜均未显示特异性荧光信号。表明QD₆13-ND-1与LEA阳性的CCL187细胞表面的结合是特异性结合。2、QD₆13-ND-1与ND-1的竞争性抑制实验将QD₆13-ND-1与不同浓度单克隆抗体ND-1进行竞争性抑制实验。随着ND-1浓度的降低,CCL187细胞表面QD₆13红色荧光信号逐渐增强,QD₆13-ND-1与CCL187细胞表面的结合可被与LEA特异性结合的单克隆抗体ND-1竞争性抑制。该结果表明细胞表面呈现的荧光信号是QD₆13-ND-1中的ND-1与细胞表面抗原特异性结合的结果。五、CdTe量子点的抗漂白能力研究以488nm激发光持续激发QD₆13和FITC为荧光标记的CCL187细胞,比较QD₆13和FITC抗光漂白能力。每285s采集一次图像,共采集图像12幅。FITC信号在激发17l0s时便淬灭显著,而QD₆13在持续激发的整个过程中荧光强度几乎无任何改变。利用共聚焦显微镜自带软件MeanROI对激发过程中平均荧光强度作时间曲线,FITC平均荧光强度下降显著,而QD₆13保持同一水平,以上数据均表明量子点的抗光漂白能力显著优于FITC。六、PEG修饰量子点降低非特异性吸附PEG对量子点的修饰初步达到了消除量子点非特异性吸附的作用。有待于进一步研究将单克隆抗体ND-1与PEG-QD₆13相偶联以制备无非特异性吸附的QD₆13-ND-1免疫荧光探针。结论本研究采用水热法成功地制备了巯基乙酸稳定的水溶性CdTe量子点,并将其与单克隆抗体ND-1共价偶联,实现了对大肠癌细胞的特异性检测。为大肠癌的早期诊断及成像研究提供了一种高灵敏度的检测手段。