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多糖是一种广泛存在于自然界的高分子化合物,是生命体中重要的生物活性物质,参与调节多种生命现象。大多数多糖具有增强免疫、抗病毒、抗氧化、抗衰老等作用,因而受到普遍重视。研究表明,一些多糖经硫酸化修饰后生物活性明显增强。板蓝根多糖是板蓝根的重要成分之一,具有抗病毒、增强免疫等作用。本研究用水煎醇沉法得到板蓝根总多糖,经Sephadex G-100分离后得到3种分级多糖,测定并筛选出体外抗病毒和增强免疫的活性部位,再进一步硫酸化修饰获得硫酸化多糖,通过比较筛选出抗病毒和增强免疫活性较好的硫酸化多糖及其最佳修饰条件。试验分为以下6个部分：试验Ⅰ、板蓝根多糖的提取及纯化用水煎醇沉法从板蓝根饮片中提取板蓝根总多糖(IRPSt),经Sephadex G-100分离后得到3种分级多糖IRPS1、IRPS2、 IRPS3,用苯酚-硫酸法测定糖含量。结果表明,板蓝根总多糖提取率为10.01%,糖含量为84.92%。3种分级多糖糖含量最高的是IRPS1,为96.61%；最低的是IRPS3,仅为40.94%。试验Ⅱ、板蓝根多糖抗病毒活性部位的筛选首先测定板蓝根总多糖IRPSt和3种分级多糖IRPS1、IRPS2、IRPS3对鸡胚成纤维细胞(CEF)的安全浓度,然后取安全浓度内5个浓度的各多糖与鸡新城疫病毒(NDV)以3种加药方式(先加多糖后加病毒、先接病毒后加多糖、多糖和病毒感作后同时)加入到CEF的培养体系中,用MTT法测定细胞的A570值,评价它们对NDV感染CEF能力的影响。结果表明,4种板蓝根多糖均能不同程度地抑制NDV感染细胞,三种加药方式中,IRPSt的抗病毒活性强于3种分级多糖,3种分级多糖中IRPS2的抗病毒活性高于IRPS1和IRPS3。试验Ⅲ、板蓝根多糖增强免疫活性部位的筛选将安全浓度内5种浓度的板蓝根总多糖IRPSt和3种分级多糖IRPS1、IRPS2、IRPS3单独或与PHA同时加入到鸡外周血淋巴细胞的培养体系中,用MTT法测定淋巴细胞增殖的变化。结果显示,多糖单独作用时,4种多糖在一定的浓度范围内均能促进淋巴细胞增殖；与PHA协同作用时,IRPS1和IRPS2表现出较强的刺激淋巴细胞增殖效应。其中IRPS2组的淋巴细胞增殖率在两种作用方式中均最高。试验Ⅳ、板蓝根多糖的硫酸化修饰 用氯磺酸-吡啶法对IRPS2进行硫酸化修饰,以氯磺酸-吡啶比例、反应温度和反应时间为因素水平,用L9(3)4正交设计9种修饰条件,修饰得到9种硫酸化板蓝根多糖,即sIRPS1、sIRPS2、sIRPS3、sIRPS4、 sIRPS5、sIRPS6、sIRPS7、sIRPS8和sIRPS9。结果显示,反应体系温度在75～85℃、氯磺酸-吡啶比例为1：8～1：6、反应时间在2～3 h时,有利于硫酸基团的取代。试验V、硫酸化板蓝根多糖抗病毒活性的比较首先测定9种硫酸化板蓝根多糖sIRPS1、sIRPS2、sIRPS3、sIRPS4、SIRPS5、sIRPS6、sIRPS7、sIRPS8、sIRPS9和板蓝根总多糖IRPSt对CEF的安全浓度,然后取其安全浓度范围内的5个浓度的各种多糖与NDV以3种方式加入到CEF的培养体系中,用MTT法测定NDV感染CEF的能力。结果显示,先加多糖时,sIRPS1、sIRPS2、SIRPS3、sIRPS4、 sIRPS5、sIKPS7、sIRPS8、SIRPS9和IRPSt的抗病毒活性显著高于sIRPS6;后加多糖时,IRPSt、IRPS2、IRPS4、IRPS7、IRPS8和IRPS9的病毒抑制率组均显著高于IRPS1、IRPS3、IRPS5和IRPS6;多糖和病毒感作后加时,IRPS4、IRPS7和IRPS8的病毒抑制率显著高于其他各组多糖。SIRPS4在三种加药方式中的病毒抑制率最高。表明硫酸化修饰能够提高板蓝根多糖的抗病毒活性,sIRPS4的活性最强。试验Ⅵ、硫酸化板蓝根多糖增强免疫活性的比较取安全浓度范围内5个浓度的9种硫酸化板蓝根多糖和板蓝根总多糖加入到外周血淋巴细胞的培养体系中,用MTT法测定淋巴细胞增殖的变化。结果显示,多糖单独刺激时,10种多糖均能刺激淋巴细胞的增殖；与PHA协同作用于淋巴细胞时,sIRPS4、sIRPS5、 sIRPS6和sIRPS7对淋巴细胞的增殖有促进作用；sIRPS4在两种作用方式中的淋巴细胞增殖率均最高。表明硫酸化修饰能够提高板蓝根多糖的免疫增强活性,SIRPS4的活性最强。因此,SIRPS4的修饰条件可以作为板蓝根多糖硫酸化修饰的最佳条件,即反应温度75℃,氯磺酸-吡啶比例1：4,反应时间2 h。