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近年来,抗体药物在医药销售市场中所占份额迅猛攀升。抗体药物一般采用CHO细胞等哺乳动物细胞培养产生,作为工艺相关杂质的宿主细胞残留DNA在经过纯化后却无法完全去除,因而抗体药物成品中还是含有残留的宿主细胞DNA。宿主细胞残留DNA存在潜在的安全性风险,包括病毒感染性、致瘤性、免疫原性、致突变等。为了监测纯化过程中宿主细胞残留DNA的去除效果,有必有建立准确度高灵敏度好的CHO细胞残留DNA检测方法。目前,已有的其他Q-PCR法测宿主细胞残留DNA方法存在灵敏度低、价格昂贵、不能识别假阴性等缺点。本研究中,采用实时定量PCR技术,开发了高准确度、灵敏度、特异性强、低成本的宿主细胞DNA残留量定量测定方法。可广泛应用于治疗性抗体药物的宿主细胞DNA残留量测定。本研究提取CHO细胞基因组DNA作为DNA残留量测定标准品,查找CHO细胞基因组DNA拷贝数较多的短重复序列作为扩增目的片段,并设计探针引物;确定Q-PCR反应体系及反应条件,绘制标准曲线,建立测定抗体药物中宿主细胞DNA残留量的检测方法,并进行了方法学验证和样品测定。本研究主要内容和结果如下:选择CHO细胞基因组DNA中拷贝数较多的Alu类似短重复序列Clone250作为扩增的目的片段,并设计了引物和Taqman探针;以CHO细胞基因组DNA标准品作为标准曲线,建立Q-PCR扩增标准曲线,能准确定量测定出抗体样品中CHO细胞DNA残留量。通过加入t RNA优化了用于CHO细胞DNA标准品稀释的缓冲液,提高了本方法的灵敏度。建立了本方法的内标质控体系,能有效的监测Q-PCR反应体系中扩增假阴性和扩增抑制作用的发生。对本方法进行了全面的方法学验证,本方法与酵母、大肠杆菌、人细胞基因组DNA均不会产生非特异扩增;精密度的RSD小于30%;样品加标回收的回收率均在70%～130间,符合50%～200%的回收率要求;CHO细胞残留DNA的定量限可达0.1 fg/μL,在1×10-4～3×102pg/μL的标准曲线范围内具有良好的线性,R2大于0.99,PCR扩增效率接近100%;满足抗体样品的CHO细胞DNA残留量测定要求。对抗体不同纯化工艺步骤的样品进行了CHO细胞残留DNA的测定,证实了生产工艺中不同纯化步骤对宿主残留DNA都有良好的去除效果,其中阴离子交换层析的去除效果最为明显,为抗体药物的纯化工艺开发优化和工艺验证提供强有力的支持。结论:本研究建立和验证了治疗性抗体药物中CHO宿主细胞DNA残留量的检测方法,与现行的《中华人民共和国药典》2015版中收录的DNA探针杂交法和荧光法等宿主细胞DNA残留量方法相比,具有特异性好、灵敏度高、精密度和准确度高、高通量等特点。与其他Q-PCR测宿主残留DNA法相比,本方法具有更高的灵敏度、低成本优势,能有效的排查假阴性和扩增抑制作用的发生。本方法已应用在多个单克隆抗体药物的临床申报,能准确测定出抗体中CHO细胞DNA残留量,确保抗体药物的安全性和质量可控性。