结肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一,已经仅次于肺癌,胃癌,位居第三位,而且发病率和死亡率逐年升高,威胁着人类的生命。结肠癌的治疗方法以手术为主,但是肿瘤转移及术后复发仍然会造成结肠癌患者的死亡。肿瘤的生长和转移是一个复杂过程,包含了多个基因的失衡。分子靶向治疗带来新的机遇,因此对于肿瘤分子靶向治疗的分子学和细胞学的研究成为热点。近年来研究发现HMGB1是一种与肿瘤的生长、浸润、转移及血管生成有密切关系的染色质蛋白。30年前,研究者因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移速度快而被命名为高迁移率族蛋白(HMG)。人的HMGB1基因位于染色体13q12,相对分子量为30×103,总共由215个氨基酸组成。HMGB1被翻译成蛋白后经糖基化,酰基化,甲基化,磷酸化等修饰加工。而只有经过酰基化和磷酸化的HMGB1才能从胞核转移到细胞质内。HMGB1可以与DNA非特异性结合,具有高度保守性,由A盒,B盒及一个高度重复并富含酸性氨基酸的C末端3个结构组成。A盒能取代全长HMGB1与受体结合但不发挥生物学作用,B盒是引起炎症反应的特异性结构,同时A盒能够拮抗B盒的作用,C端主要调节与DNA的亲和力。HMGB1广泛存在于淋巴组织,脑,肝,肺,心,脾和肾等组织。不同器官组织中的HMGB1的分布不同,在肝和脑组织中主要分布于胞浆,而其他组织大多存在于胞核。近年来发现,HMGB1在各种肿瘤组织中呈现高表达现象。在肝癌,胃癌,结直肠癌,前列腺癌,胰腺癌,膀胱癌,口腔癌,鼻咽癌及乳腺癌中均出现了高表达。在正常结肠组织中,HMGB1不表达,而在结肠癌旁组织中,HMGB1呈弱阳性表达,在结肠癌组织中,呈强阳性表达,差异具有统计学意义。同时体外培养结肠癌细胞系(SW480,SW620,LOVO,DLD-1,HCT-116,HT-29)发现,同样也出现了HMGB1高表达现象。另有研究证明HMGB1可以增强肿瘤细胞的增殖,侵袭迁移,逃避凋亡等,促进了肿瘤的发生发展。同时研究证明敲除HMGB1之后,肿瘤细胞的增殖,侵袭迁移能力下降,凋亡增多。证明了HMGB1可能成为一个抗癌的靶基因。主要的机制可能是HMGB1与受体RAGE结合后,激活P38, JNK, ERK1/2等通路,继而激活基质金属蛋白酶9(MMP-9)、基质金属蛋白酶2(MMP—2)。HMGB1与受体RAGE的相互作用可激活NF-K B,调节相关凋亡因子,使肿瘤细胞逃避凋亡。HMGBl还可以作为一种促血管生长因子,通过与受体RAGE, TLR2, TLR4结合,上调白细胞黏附分子,从而诱导内皮细胞和造血细胞促进血管内皮生长因子(VEGF)的分泌维持血管生成。HMGB1可以促进内皮细胞的活化,免疫细胞的激活,诱导炎症因子的释放。大量的研究表明HMGB1参与肿瘤细胞的发生发展,侵袭和转移,HMGB1可能成为肿瘤诊断新的分子标志物和肿瘤治疗的潜在靶点。乌司他丁(UTI)是一种尿胰蛋白酶抑制剂,可以抑制多种蛋白酶的活性,能够抑制胰蛋白酶,透明质酸酶,弹性蛋白酶,血浆酶,尿激酶型纤溶酶原激活物,基质金属蛋白酶等,从而能够抑制肿瘤恶化,乌司他丁在肿瘤治疗中的作用得到重视。目前的研究主要是针对乌司他丁对UPA(纤维蛋白酶激活因子),CD44, MMP-9, MMP-2, VEGF等的作用。Ryo Tanaka发现乌司他丁能够在炎症过程中抑制HMGB1的产生。目前国内外尚未有乌司他丁对结肠癌的影响的研究。本研究采用了乌司他丁作用于体外培养的人结肠癌lovo细胞,并对以下两方面进行研究：1.探讨乌司他丁对人结肠癌lovo细胞增殖,侵袭,凋亡方面的影响；2.探讨乌司他丁对人结肠癌lovo细胞HMGB1, NF-κB的表达和HMGB1分布的影响。实验方法1.实验分组将人结肠癌lovo细胞分为4组,对照组即不给于任何处理,乌司他丁低剂量组U1(400U/m1),乌司他丁中剂量组U2(800U/m1),乌司他丁高剂量组U3(1600U/ml)2.Lovo细胞的增殖实验采用MTT法。将lovo细胞以4×10‘/ml接种于96孔培养板中,按照上述分组进行处理,每孔培养基总量200μ1,37℃5%CO2培养箱中培养,进行培养24、48、72h,同时设空白对照组。每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml),继续培养4h；吸出孔内培养液后,每孔加入150μl DMSO,室温下,将平板置于振荡器上振荡10min,使结晶物溶解。在酶联免疫检测仪上490nnm波长处测定各孔吸光度值,并按下式计算细胞增殖抑制率。抑制率(%)=(1-实验组A490／对照组A490)×100%。实验重复3次。3.Lovo细胞的侵袭实验将transwell、室铺好胶备用。将人结肠癌lovo细胞按照上述分组处理24小时后,用无血清培养液重悬后取200μ1接种于transwell小室的上层内,细胞按照5×105/ml接种。10%胎牛血清的DMEM培养液加入下室,置37℃,5%CO2培养箱中培养24小时。取出小室,PBS轻洗小室上室并用移液枪弃液,湿棉签轻擦去除小室上室的细胞和Matrigel胶；移至预先加好的4%多聚甲醛孔中固定30分钟,PBS液轻洗数次。加入500μ10.1%结晶紫溶液,将小室膜浸没在其中,置于37℃5%CO2培养箱中孵育30min,显微镜下拍照(×200),计数细胞数,实验重复3次。4.Lovo细胞的Caspase-3活性检测将结肠癌lovo细胞按照上述分组处理24小时后,按照美国BioVision公司的caspase-3试剂盒进行操作。实验重复3次。5.各组HMGBlmRNA的表达将结肠癌lovo细胞按照上述分组处理24小时后,运用半定量逆转录一聚合酶链反应(reverse transeriptase-polymeraseehainreaetion,RT-PCR)检测lovo细胞中HMGBlmRNA的表达情况6.各组MGB1, NF-KB蛋白的表达将结肠癌lovo细胞按照上述分组处理24小时后,采用Western blotting检测HMGB1和NF-KB蛋白的表达7.细胞免疫荧光将lovo细胞以1×104/ml接种于铺有盖玻片的96孔培养板中,按照上述分组进行处理,培养24h。吸出培养液,4%多聚甲醛室温下固定30分钟,PBS洗三遍,0.1%TX-100温室下作用10分钟使细胞膜通透性增加,PBS冲洗,10%i正常血清封闭10分钟,加入一抗HMGB1,4度孵育过夜(抗体浓度1：100),PBS冲洗3次,每次5分钟。加入荧光二抗抗兔(1：50),4度避光孵育1小时,PBS冲洗3次,每次5分钟。加入hoechst(1：50)常温避光孵育30min,PBS冲洗3次,每次5分钟。荧光显微镜下观察拍照。统计学处理采用SPSS13.0统计学软件进行分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,增殖,侵袭,凋亡的比较采用单因素方差分析。组间多重比较采用LSD(方差齐)或Dunnett’sT3(方差不齐)。P<0.05表示差异具有统计学意义。实验结果1.各组lovo细胞增值抑制率的比较与对照组相比,乌司他丁处理组可以明显抑制lovo细胞的增殖(P<0.05)。不同处理组间两两比较,除UTI中剂量组(U2)与UTI高剂量组(U3)之间无统计学意义的差异外(P>0.05),余下不同组两两比较均有显著性差异(P<0.05)。而且随着作用时间的延长,抑制作用越明显(P<0.05)。2.各组lovo细胞侵袭能力的比较与对照组相比,乌司他丁各处理组的穿膜细胞数目均减少(P<0.05),结肠癌lovo细胞的侵袭能力下降。不同处理组间两两比较,除UTI中剂量组(U2)与UTI高剂量组(U3)之间无统计学意义的差异外(P>0.05),余下不同组两两比较均有显著性差异(P<0.05)。3.各组lovo细胞caspase-3活性的比较与对照组相比,不同浓度乌司他丁处理组的caspase-3活性提高,其差异具有统计学意义(P<0.05),随着乌司他丁浓度增加,caspase-3活性升高越明显,其差异具有统计学意义(P<0.05)。4.各组lovo细胞的]SMGBlmRNA和蛋白表达的比较与对照组相比,不同浓度乌司他丁处理组的HMGB1mRNA表达下降,其差异具有统计学意义(P<0.05),且随着乌司他丁浓度增加,下降越明显,各处理组间的差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,不同浓度乌司他丁处理组的HMGB1蛋白水平表达下降,其差异具有统计学意义(P<0.05),且随着乌司他丁浓度的增加,下降越明显,各处理组间的差异具有统计学差异(P<0.05)。5.各组lovo细胞的NF-KB蛋白表达的比较与对照组相比,不同浓度乌司他丁处理组的NF-KB蛋白水平表达下降,其差异具有统计学意义(P<0.05),且随着乌司他丁浓度的增加,下降越明显,各处理组间的差异具有统计学差异(P<0.05)。6.各组lovo细胞的HMGB1表达分布的比较结果显示,对照组的HMGB1细胞核和细胞内的HMGB1均有较高表达,而乌司他丁作用后,HMGB1主要表现在细胞核内,细胞质内的HMGB1表达不明显。(由于乌司他丁处理组间的差异不明显,所以只取400U/ml的乌司他丁处理组。)结论：乌司他丁可以抑制结肠癌lovo细胞的增殖、侵袭、增加caspase-3的活性,可能的机制是乌司他丁通过抑制了HMGB1及NF-KB的表达,以及抑制HMGB1由胞核向细胞质的转移有关。