目的:系统性红斑狼疮(systemic erythematosus lupus,SLE)是一种以血清中出现多种自身抗体为特点,病变累及多系统、多器官,严重影响人类身体健康和心理健康的自身免疫性疾病。SLE天然免疫内中性粒细胞的异常特征引起的免疫反应如异常招募、凋亡或形成细胞外诱捕网,最终导致自身抗体形成及免疫复合物沉积于组织器官,越来越受到研究者的重视。乳脂球生长因子Ⅷ(milk fat globule EGF-factor Ⅷ,MFG-E8)是一种存在于多种物种体内的亲脂性糖蛋白,其最初被发现是它作为一个桥梁分子,介导凋亡细胞的清除。由于清除凋亡细胞能力受损,凋亡细胞继发性坏死释放炎性或免疫原性自身抗原如高迁移组box-1蛋白(high mobility group box-1,HMGB-1)和dsDNA等,MFG-E8敲除小鼠能自发形成类似于SLE的自身免疫性疾病。然而,MFG-E8是否能通过改善SLE内中性粒细胞的异常免疫反应,进而缓解系统性组织损伤,目前尚无研究。因此,本研究旨在探索MFG-E8调控SLE天然免疫中中性粒细胞异常免疫反应的作用机制。方法:(1)检测SLE病人与降植烷(Pristane)诱导的小鼠SLE模型中MFG-E8水平:选取临床上药物处理或未进行药物干预的女性SLE患者样本51例及35例健康对照样本(年龄20-45岁,武汉市第一医院),ELISA检测血清中MFG-E8浓度。腹腔注射0.5 mL Pristane诱导SLE模型小鼠(24周),ELISA检测其血清中MFG-E8含量。同时,利用ELISA检测早期炎症反应期(2周),小鼠肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)、腹腔灌洗液中MFG-E8水平,并利用western blot检测肺组织中MFG-E8的表达量。(2)检测MFG-E8对Pristane诱导的SLE小鼠肺脏及腹腔早期炎症反应的影响:同窝、雌性、周龄匹配的野生型(wild-type,WT)与构建的MFG-E8基因敲除(Mfge8-/-)小鼠分别注射Pristane构建SLE模型,分别在诱导16小时、5天、10天、14天后利用流式细胞术检测腹腔及BALF中总细胞、CD11b+细胞、中性粒细胞及巨噬细胞数量。同时,ELISA检测Pristane诱导Mfge8-/-及WT小鼠腹腔灌洗液及BALF中细胞因子如IL-6、IL-12/IL-23p40、TNFα、IL-1β、IL-10、TGF-β1 及趋化因子 MIP-2 的含量。另外,分别利用流式细胞术及ELISA检测Pristane诱导2周后WT及Mfge8-/-小鼠腹腔灌洗液中单核细胞比例及IFN-α含量。Pristane注射2周后引起肺泡弥漫性出血,H&E染色分析WT及Mfge8-/-小鼠肺泡出血比例及出血指数,并检测肺组织中中性粒细胞的浸润及渗漏的总蛋白含量。同时,H&E或PAS染色检测脾、肝及肾-脏组织病理学及炎症细胞浸润变化。(3)探索MFG-E8调节Pristane诱导小鼠早期炎症中中性粒细胞招募的分子机制:早期炎症反应中,MFG-E8缺失导致中性粒细胞在肺组织及腹腔中的招募显著升高,为进一步验证MFG-E8对其迁移的影响,本课题设计体内外实验检测WT及Mfge8-/-中性粒细胞的趋化效率。分别将WT及Mfge8-/-小鼠骨髓中percoll分离的中性粒细胞(4×106)标记不同的荧光标记(PKH26、PKH67)后等量地尾静脉注射于WT小鼠(提前1小时注射Pristane)体内,16小时后流式细胞术检测BALF及腹腔灌洗液中不同荧光标记的中性粒细胞比例。同时,利用Transwell小室体外检测WT及Mfge8-/-小鼠骨髓来源的中性粒细胞迁移效率。腹腔注射rmMFG-E8(recombinant murine MFG-E8,20μg/kg)干预Pristane诱导的SLE小鼠,16小时后检测腹腔灌洗液及BALF中中性粒细胞数量;同时,体外给予500 ng/mLrmMFG-E8预处理后,检测其对骨髓来源中性粒细胞迁移的影响。ELISA检测Pristane诱导Mfge8-/-及WT小鼠BALF及腹腔灌洗液中中性粒细胞趋化因子MIP-2浓度水平,并且利用流式细胞术检测野生型及Mfge8-/-小鼠骨髓中分离的中性粒细胞表面趋化因子受体CXCR2(CD182)的表达量。选取临床上给予药物治疗或未经药物处理的年轻女性SLE患者52例及对应年龄的健康对照组36例,流式细胞术检测外周血中性粒细胞比例及其细胞表面受体CXCR2的表达量;其中各选取12例SLE患者及健康对照组外周血,分离中性粒细胞并加入500 ng/mL rhMFG-E8(recombinant human MFG-E8)体外培养后流式细胞术检测细胞表面受体CXCR2表达量的变化。在Pristane诱导的小鼠模型中,分别分离WT小鼠、Pristane诱导16小时后WT小鼠及提前给予rmMFG-E8治疗的Pristane诱导小鼠骨髓中性粒细胞,分别用流式细胞术检测表面受体CXCR2的表达量。(4)MFG-E8对SLE模型小鼠细胞凋亡的影响:Pristane注射WT及Mfge8-/-小鼠5天后,经Annexin V及PI染色后流式细胞术检测BALF及腹腔灌洗液中凋亡细胞的比例。同时,利用末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)检测Pristane刺激3不同小鼠14天后肺组织中细胞凋亡情况;并且利用western blot检测肺组织中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bcl-xL及Bax的表达量。另外,免疫荧光检测WT及Mfge8-/-小鼠腹腔中活化巨噬细胞吞噬凋亡中性粒细胞及荧光微球的效率。(5)MFG-E8对SLE模型小鼠中性粒细胞释放中性粒细胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)的影响:NETosis作为中性粒细胞一种特殊的死亡形式,释放大量与SLE自身抗体相关的自身抗原。免疫荧光检测WT及Mfge8-/-小鼠骨髓中分离的中性粒细胞自发及PMA、LPS和MIP-2刺激释放NETs的含量。Pristane诱导WT及Mfge8-/-小鼠24周后,收集血清,检测两种血清诱导WT小鼠中性粒细胞释放NETs的比例,并检测血清中诱导NETs释放的刺激成分,如抗NET抗体、循环免疫复合物(circulating immune complexes,CICs)、TNFα 及 MIP-2。同时,利用免疫荧光检测 SLE模型小鼠肺、肾组织中NETs的形成。(6)检测自身抗体的产生及免疫复合物沉积:Pristane刺激24周后,解剖学检测WT及Mfge8-/-小鼠脾脏大小及H&E染色分析脾组织病理学改变;同时,利用H&E或PAS染色检测肝、肺及肾脏组织病理学改变。免疫荧光检测Pristane诱导WT及Mfge8-/-小鼠24周后血清中ANA、抗dsDNA抗体及ANCA的滴度;利用直接免疫荧光检测肺、肾组织中免疫复合物(IgG和C3)的沉积情况;ELISA检测尿液中白蛋白、肾损伤因子-1(Kim-1)的含量,并利用肌氨酸氧化酶法(Sarcosine oxidase enzymatic assay,SOE assay)检测尿液中肌酐的含量。结果:(1)MFG-E8是SLE患者及SLE模型小鼠发病机制中重要的调控因子:SLE患者及注射Pristane 24周后WT小鼠血清中MFG-E8浓度显著高于正常对照组。在早期炎症时期,即Pristane诱导14天后,WT小鼠BALF及腹腔灌洗液中MFG-E8浓度显著升高;同时,小鼠肺组织中MFG-E8的表达量也显著高于未给予Pristane刺激的WT小鼠。结果表明,在SLE患者及SLE模型小鼠中,MFG-E8在发病机制中发挥着重要的作用。(2)MFG-E8缺失加重SLE模型小鼠肺脏及腹腔中炎症反应:在SLE患者及SLE模型小鼠体内MFG-E8水平显著上调,然而当MFG-E8敲除后,Pristane诱导小鼠的早期炎症反应加重。注射Pristane 16小时、5天、10天及14天后,Mfge8-/-小鼠BALF中总细胞、中性粒细胞及巨噬细胞浸润明显高于WT小鼠;同时,Mfge8-/-、鼠腹腔灌洗液中总细胞、CDllb+细胞、中性粒细胞招募明显增多,但巨噬细胞减少。随着Pristane刺激的Mfge8--小鼠肺脏及腹腔中大量炎症细胞浸润,BALF及腹腔灌洗液中促炎细胞因子如IL-6、IL-12/IL-23p40、TNF-α显著高于WT小鼠,并且腹腔中抗炎细胞因子IL-10及TGF-β1明显降低。注射Pristane 14天后,Mfge8-/-小鼠腹腔灌洗液中单核细胞的比例明显高于WT小鼠,且分泌的IFN-α浓度明显上调。由于Pristane刺激C57BL/6小鼠2周后,肺泡呈现弥散性红细胞浸润(diffuse pulmonary hemorrhage,DPH),本研究中,注射Pristane 2周后Mfge8-/-小鼠中肺完全出血的比例明显高于WT小鼠,表现为出血比例及出血指数明显升高,伴随着中性粒细胞浸润明显加重及BALF中蛋白水平急剧升高。另外,Mfge8-/-及WT小鼠肝脏、肾脏及脾脏组织中也有不同程度的病理学改变。(3)MFG-E8通过调节趋化因子受体CXCR2表达来调控SLE小鼠中性粒细胞招募:本课题研究结果表明,与WT小鼠相比,尾静脉注射Mfge8-/-小鼠骨髓中性粒细胞招募至Pristane刺激的肺组织及腹腔中的数量显著增高,且体外培养的Mfge8-/-小鼠骨髓中性粒细胞趋化效率显著增高。外源性给予rmMFG-E8干预后,Pristane诱导的WT及Mfge8-/-小鼠肺组织及腹腔内中性粒细胞招募比未给予rmMFG-E8治疗的减少。体外给予rmMFG-E8预处理后,WT及Mfge8-/-骨髓来源中性粒细胞对MIP-2的趋化能力明显低于未给予rmMFG-E8干预的细胞。进一步检测发现,Pristane刺激的Mfg8-/-及WT小鼠BALF及腹腔灌洗液中MIP-2的水平并没有显著性差异,而作为趋化因子MIP-2的受体,CXCR2在M/ge8-/-中性粒细胞表面的表达量明显高于WT小鼠中性粒细胞。同时,检测收集的SLE患者外周血内中性粒细胞表面CXCR2表达,结果发现SLE患者外周血中性粒细胞细胞比例明显高于健康对照组,并且细胞表面CXCR2的表达量也显著高于对照组;而当外源给予rhMFG-E8治疗时,SLE患者外周血中性粒细胞表面CXCR2的表达显著下调。同时,Pristane诱导SLE小鼠骨髓中分离的中性粒细胞表面CXCR2的表达也显著高于未经处理的WT小鼠;且给予rmMFG-E8干预后,细胞表面CXCR2的表达量明显降低。(4)MFG-E8缺失导致SLE模型小鼠体内凋亡细胞积聚:Pristane刺激5天后,Mfge8-/-小鼠BALF及腹腔灌洗液中早期凋亡细胞及晚期凋亡细胞比例明显高于WT小鼠。Pristane刺激14天后,H&E染色及TUNEL检测发现大量死亡细胞沉积在Mfge8-/-小鼠肺泡间质,且Mfge8-/-肺组织中Bcl-2、Bcl-xL蛋白表达明显下调,而Bax蛋白表达显著升高,Bcl-2/Bax比例显著性低于WT小鼠。同时,本研究证实Mfge8-/-小鼠腹腔内富集的活化巨噬细胞吞噬凋亡中性粒细胞及荧光微球的能力显著低于WT小鼠。因此,结果表明,较多的凋亡细胞沉积于Mfge8-/-小鼠炎性组织,一方面是由于过多的炎症细胞如中性粒细胞招募,在炎症环境下发生凋亡;另一方面是由于Mfge8-/-巨噬细胞吞噬凋亡细胞的能力受损。(5)MFG-E8缺失导致中性粒细胞释放更多的NETs:本研究结果发现,无论是自发诱导,还是LPS、MIP-2刺激后,与WT小鼠相比,Mfge8-/-小鼠骨髓中性粒细胞释放NETs明显增多。Pristane诱导24周后收集的Mfge8-/-小鼠血清刺激WT中性粒细胞释放NETs的能力显著高于WT小鼠血清;进-步检测发现Mfge8-/-小鼠的血清中CICs、TNFα水平明显高于WT小鼠,MIP-2水平呈升高趋势,且抗NET抗体(结合NETs,抑制NETs被降解)水平显著高于WT小鼠。同时,免疫荧光检测发现注射Pristane 2周后,Mfge8-/-小鼠肺泡间质就开始产生NETs,直至24周后,肺泡间质中大量的NETs沉积;同时,Pristane刺激24周后,Mfge8-/-小鼠肾小球周围发现NETs形成。(6)MFG-E8缺失加速SLE小鼠自身抗体产生及免疫复合物沉积:Pristane刺激或未刺激Mfge8-/-小鼠24周后,小鼠脾脏明显肿大,且伴有明显的B细胞滤泡扩大(白髓区域增大)、脂肪滴浸润增多及巨核细胞招募增多等病理现象。Pristane刺激的Mfge8-/-小鼠肺积肝脏也呈现一些病理学异常。H&E染色观察发现Mfge8-/-小鼠肺组织中支气管壁增厚、异位淋巴细胞异常聚集在支气管周围,铁血黄素-巨噬细胞浸润;同样地,Mfge8-/-小鼠肝脏内中性粒细胞、油滴及异位淋巴细胞或肉芽肿明显增加。Mfge8-/-小鼠血清中ANA、抗dsDNA抗体、ANCA滴度明显高于WT小鼠,且Mfge8-/-小鼠血清中ANCA多为p-ANCA(MPO-ANCA),而野生型小鼠血清中多为c-ANCA(PR3-ANCA)。同时,与野生型相比,Mfge8-/-小鼠肺及肾脏中免疫复合物沉积显著增多,且Mfge8-/-小鼠肺组织中免疫复合物主要沉积于肺泡间质,而WT小鼠免疫复合物主要沉积于肺小血管和毛细血管周围。MFG-E8缺失后,经Pristane刺激的小鼠尿液中白蛋白/肌酐比例及Kim-1浓度明显升高。结论:MFG-E8通过调控细胞表面受体CXCR2的表达缓解SLE天然免疫中中性粒细胞的异常反应,如减少中性粒细胞招募、促进凋亡中性粒细胞有效清除、抑制NETs释放等,有效减少IFN-α、自身抗体ANA、抗dsDNA抗体、ANCA的产生及免疫复合物沉积,最终改善SLE累及的组织损伤。因此,MFG-E8可作为环境因素引起SLE早期炎症的一种有效治疗手段。