1.研究背景研究证实,行为、中枢神经系统(Central nervous system,CNS)、肠道微生物和肠道功能之间存在极为复杂的交互影响,从而给临床工作带来巨大困惑。应激可通过微生物-肠-脑(microbiota-gut-brain,MGB)轴对肠道功能和肠道菌群施加影响,而肠道微生物亦可通过MGB轴影响个体行为和大脑功能。MGB轴是由免疫、神经和内分泌系统共同参与组成的复杂的多器官交互作用通路,其在维持机体生理功能、内环境稳态、生长发育和代谢过程中发挥极其重要的作用。MGB轴具有双向性的作用特点,一方面可以下传CNS对肠道和肠道微生物群的影响信号,如中枢通过肠神经元-胶质细胞-上皮轴和内脏神经影响肠道平滑肌蠕动及粘膜分泌,调控肠道粘膜免疫细胞释放细胞因子,进而影响肠道微环境和肠道微生物群;另一方面,该轴亦上传肠道微生物群改变对个体行为、大脑发育及功能的影响信号。肠道微生物群与CNS之间的交互影响近年来一直是研究的热点,但其影响机制和因果关系尚不明确。一氧化氮(Nitric oxide,NO)在应激诱导的神经行为、免疫、胃肠道、内分泌功能改变和应激反应调节中起关键作用。iNOS诱导的NO过量产生与多种胃肠道疾病的组织损伤有关,而抑制iNOS可明显改善肠道的组织损伤。另一方面,NO在应激相关疾病的发生发展过程中起重要作用。慢性应激可导致iNOS诱导的NO过量释放,后者引起下丘脑-垂体-肾上腺(Hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)轴功能失调节。HPA轴活化被认为是应激反应的关键性生理机制之一,HPA轴功能失调节在抑郁症等应激相关障碍发病过程中起到极其重要的病因学作用。应激可通过核转录因子-κB(Nuclear transcriptrion factor κB,NF-κB)途径增加大脑皮层iNOS的表达。目前,NF-κB、iNOS衍生NO是否参与了肠道菌群对个体行为和CNS的影响及作用机制未见报道。本研究中,我们通过分析慢性不可预期性温和应激对肠道功能和肠道菌群的影响,从中枢神经系统对肠道和肠道微生物群的影响角度自上而下研究两者之间交互作用的分子机制;另外,我们基于第一部分研究筛选靶向菌群,通过特异性干预肠道菌群,从肠道微生物群对中枢神经系统的影响角度自下而上研究两者之间的交互作用机制。2.研究目的2.1观察慢性不可预期性温和应激对大鼠行为、体重和结肠组织的影响。2.2探讨慢性不可预期性温和应激致大鼠行为和结肠组织改变的分子机制。2.3探讨慢性不可预期性温和应激对肠道菌群影响及其分子机制,并筛选生物标识菌群。2.4通过靶向干预肠道菌群建立模型,探讨特异性干预肠道菌群对大鼠行为的影响及其分子机制。3.材料与方法3.1慢性不可预期性温和应激对大鼠肠道功能和肠道菌群的影响及其分子机制3.1.1实验动物分组及模型制备40只雄性Wistar大鼠适应1周后随机分为4组:对照组,CUMS组,CUMS+FLX组和CUMS+PDTC组,每组10只。对照组大鼠每日腹腔注射无菌生理盐水。其他实验组大鼠每天于CUMS暴露前30分钟腹腔注射二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC,100 mg/kg)或氟西汀(10 mg/kg)或无菌生理盐水。CUMS模型建立:大鼠每日随机暴露于下列应激源:禁食(24h)、禁水(24 h)、夹尾(1 min)、昼夜颠倒(12 h/12h)、噪声暴露(1h、1500赫兹、92分贝)、束缚应激(1 h)、摇晃(15 min),总暴露28天。3.1.2行为学检测和体重测量模型建立完毕后进行行为学测试,测试顺序为旷场实验和糖水偏好实验。所有大鼠每日测量体重至第28天。3.1.3亚硝酸盐产物(NO)测量亚硝酸盐水平间接反应脊髓L1-2和结肠组织内NO产物的含量,按照亚硝酸盐检测试剂盒进行操作。3.1.4 HE染色观测结肠组织形态学改变。3.1.5酶联免疫吸附试验检测血清皮质酮水平。3.1.6免疫印迹法检测脊髓L1-2和结肠组织iNOS,胞核NF-κB和胞浆IκB蛋白表达。3.1.7实时定量PCR检测脊髓L1-2和结肠组织iNOS mRNA表达水平。3.1.8 Miseq高通量测序技术检测大鼠粪便16s rDNA V3+V4区域以分析各组大鼠的粪便微生物群多样性和菌群组成。3.2靶向干预肠道菌群对大鼠行为的影响及其分子机制3.2.1实验动物分组及模型建立50只雄性Wistar大鼠适应1周后随机分为5组:对照组:隔日给予无菌生理盐水1 ml灌胃,灌胃半小时后给予无菌生理盐水1 ml腹腔注射;乳酸杆菌组:隔日给予乳酸杆菌(1 ml,106 CFU/ml)灌胃,灌胃半小时后给予无菌生理盐水1 ml腹腔注射;乳酸杆菌+PDTC组:隔日给予乳酸杆菌(1 ml,106 CFU/ml)灌胃,灌胃半小时后给予PDTC(1ml,50 mg/kg)腹腔注射;大肠埃希菌组:隔日给予大肠埃希菌(1 ml,106 CFU/ml)灌胃,灌胃半小时后给予无菌生理盐水1 ml腹腔注射;大肠埃希菌+PDTC组:隔日给予大肠埃希菌(1 ml,106 CFU/ml)灌胃,灌胃半小时后给予PDTC(1 ml,50mg/kg)腹腔注射。3.2.2 Miseq高通量测序技术检测大鼠粪便16s rDNAV3+V4区域,分析各组大鼠的粪便微生物群多样性和菌群组成,评估动物模型是否建立成功。3.2.3模型建立完毕后行行为学测试,测试顺序为旷场实验、高架十字迷宫、糖水偏好实验和强迫游泳实验。3.2.4取大鼠海马和前额叶(Prefrontal cortex,PFC)组织,硝酸还原酶酶法将硝酸盐转化为亚硝酸盐,然后用Griess试剂在550nm的吸光度下对亚硝酸盐进行定量。3.2.5 HE染色观测海马和PFC组织形态学变化。3.2.6酶联免疫吸附试验检测血清皮质酮水平。3.2.7免疫印迹法检测大鼠海马和PFC组织iNOS,NF-κB和IκB蛋白表达。4.实验结果4.1慢性不可预期性温和应激对大鼠肠道功能和肠道菌群的影响及其分子机制4.1.1 NF-κB抑制剂PDTC对CUMS大鼠体重的影响CUMS组大鼠较对照组体重增长趋缓(day=7,p<0.5;day=14,p<0.01)。氟西汀干预较CUMS组无明显差异。PDTC干预较CUMS组体重明显增加(day=7,p<0.5;day=14,p<0.01)。4.1.2.NF-κB抑制剂PDTC对CUMS大鼠血清皮质酮水平的影响CUMS组大鼠较对照组血清CORT水平明显升高,给予氟西汀和PDTC干预均可抑制CUMS导致的大鼠血清CORT水平升高,从而抑制HPA轴持续活化。4.1.3 NF-κB抑制剂PDTC对CUMS大鼠行为改变的影响旷场实验结果显示,CUMS大鼠焦虑样行为增加:中央格停留时间减少和修饰次数较对照组明显增加;抑郁样行为明显增加:穿越格数和直立次数较对照组明显减少;氟西汀和PDTC预处理可显著性抑制上述改变。糖水偏好实验结果显示,CUMS组大鼠较对照组蔗糖消耗显著性降低,提示抑郁样行为增加;PDTC和氟西汀干预均能明显抑制上述行为改变。4.1.4 NF-κB抑制剂PDTC对CUMS大鼠结肠组织损伤的影响HE染色显示,CUMS可引起大鼠结肠黏膜固有层隐窝结构紊乱、萎缩,部分隐窝消失,其周围隐窝扩张,部分表面上皮变性坏死并脱落,炎症较轻。PDTC干预而非氟西汀可逆转CUMS引起的大鼠结肠组织损伤。4.1.5 NF-κB抑制剂PDTC对CUMS大鼠脊髓和结肠组织NO水平的影响CUMS组较对照组脊髓L1-2和结肠组织NO水平均显著性升高。氟西汀干预不能抑制CUMS引起的上述改变。PDTC干预可明显抑制CUM导致的脊髓L1-2和结肠组织NO过量表达。4.1.6 NF-κB抑制剂PDTC对CUMS大鼠脊髓和结肠组织iNOS和NF-κB的影响CUMS组较对照组脊髓L1-2和结肠组织iNOS表达上调,氟西汀干预不能逆转该过程,而PDTC干预可导致两部位iNOS表达明显下降。进一步地,CUMS组较对照组脊髓L1-2和结肠组织iNOS mRNA表达上调,氟西汀和PDTC预处理均能显著性降低两部位iNOS mRNA表达。CUMS组较对照组脊髓L1-2和结肠组织中胞核NF-κB表达上调和胞浆IκB表达下调。氟西汀干预不能逆转该过程。PDTC干预可明显逆转脊髓L1-2和结肠组织中CUMS诱导的NF-κB激活,从而降低下游iNOS诱导NO的过量表达。4.1.7 NF-κB抑制剂PDTC对CUMS大鼠粪便微生物群的影响及机制肠道微生物群丰度和多样性分析:Chao指数student’s t-test检测显示各组间菌群丰度无明显差别,Shannon指数student’s t-test检测结果显示,CUMS组较对照组无差异,氟西汀组较PDTC组OTU多样性明显升高,可能的解释为CUMS暴露可导致肠道病原菌增多进而引起菌群多样性改变。通过未加权unifrac距离算法在OTU水平对菌群β多样性进行主坐标分析(PCoA),结果显示CUMS组与对照组明显分离,提示CUMS暴露可明显改变肠道微生物群结构;氟西汀组与CUMS组分离现象不明显;PDTC组较CUMS组出现显著分离,提示PDTC而非氟西汀可逆转CUMS导致的肠道菌群多样性改变。肠道菌群分类学分析:CUMS组大鼠较对照组疣微菌门(Verrucomicrobia)和衣原体门(Chlamydiae)两种病原菌门显著性增加。氟西汀组与CUMS组无明显差异。PDTC干预后可见疣微菌门明显降低,而衣原体门显著性增加。在属水平上均值总和前20个物种中,CUMS组较对照组大肠埃希菌志贺氏菌和瘤胃球菌属1显著性增多;Prevotellaceae-UCG-003明显减少。氟西汀干预较CUMS组无明显变化。PDTC干预较CUMS 组 Ruminococcaceae-UCG-005和 Ruminococcaceae-NK4A214-group均明显减少,且大肠埃希菌志贺氏菌属存在下降趋势(P=0.065),考虑可能为样本太小导致差异不明显。组间差异物种的线性判别分析(LEfSe):为了筛选组间具有显著差异的物种Biomarker,通过线性判别分析(LDA)实现降维并估算差异物种丰度对差异效果影响的大小,筛选出大肠埃希菌志贺氏菌属为生物标识菌属。4.2靶向干预肠道菌群对大鼠行为的影响及其分子机制4.2.1肠道菌群定殖模型28天造模结束,大肠埃希菌组较对照组大肠埃希菌群占比明显增加,提示大肠埃希菌定殖成功;乳酸杆菌组较对照组大鼠乳酸杆菌群占比显著性增加,提示乳酸杆菌定殖成功。模型建立后各组大鼠均未见有腹泻和水样便。收集4h内的粪便,结果显示,乳酸杆菌组较对照组无明显差异。大肠埃希菌组较对照组粪便颗粒数明显增加,给予PDTC干预后粪便颗粒数明显减少。4.2.2大肠埃希菌肠道定殖对血清CORT的影响乳酸杆菌组及乳酸杆菌+PDTC组较对照组血清CORT水平无明显差异。大肠埃希菌组大鼠较对照组血清CORT水平明显升高,给予PDTC干预后血清CORT水平明显降低。4.2.3大肠埃希菌肠道定殖对大鼠行为学的影响乳酸杆菌组及乳酸杆菌+PDTC组较对照组行为无明显变化。旷场实验显示,大肠埃希菌组大鼠较对照组焦虑样行为增加:中央格停留时间明显减少,修饰次数显著性增加。高架十字迷宫结果显示,大肠埃希菌组大鼠较对照组焦虑样行为增加:开放臂停留时间和开放臂进入次数明显减少。各组间抑郁样行为无明显差异。给予PDTC干预后可显著抑制大肠埃希菌导致的焦虑样行为增加。4.2.4大肠埃希菌肠道定殖对大鼠海马和PFC组织形态的影响乳酸菌组、乳酸菌+PDTC组和对照组大鼠海马和PFC区形态学表现基本一致。大肠埃希菌组大鼠海马DG区颗粒细胞明显减少,排列紊乱,细胞间隙增大,核固缩、核仁消失,多数细胞萎缩、变形,细胞核固缩、核仁模糊。大肠埃希菌+PDTC组大鼠较大肠埃希菌组细胞形态明显好转,但较对照组仍有较多细胞坏死和核固缩现象。大肠埃希菌组大鼠PFC锥体细胞排列紊乱,细胞体积减小,多数细胞变形,细胞核固缩,核仁模糊不清。大肠埃希菌+PDTC组大鼠较大肠埃希菌组细胞形态明显好转,但较对照组细胞间隙增加,细胞排列相对不规则。4.2.5大肠埃希菌肠道定殖对大鼠海马和PFC组织NO含量的影响乳酸杆菌组及乳酸杆菌+PDTC组较对照组大鼠海马和PFC组织中NO水平无明显差异。大肠埃希菌组较对照组大鼠海马和PFC组织NO水平明显升高。PDTC干预后海马和PFC组织NO水平均显著降低。4.2.6大肠埃希菌肠道定殖对大鼠海马和PFC组织iNOS、NF-κB蛋白表达的影响。乳酸杆菌组及乳酸杆菌+PDTC组较对照组大鼠海马和PFC组织中iNOS水平无明显差异。大肠埃希菌组较对照组大鼠海马和PFC组织中iNOS蛋白表达显著性升高;胞核NF-κB蛋白表达上调和胞浆IκB蛋白降低。PDTC干预可明显抑制上述改变,提示大肠埃希菌致肠道菌群失调导致NF-κB激活,下游iNOS衍生NO表达明显增加,从而导致海马和PFC组织受损,大鼠出现焦虑样行为。5.结论5.1 CUMS暴露可导致大鼠抑郁和焦虑样行为明显增加,同时伴有结肠组织受损和体重增长趋缓。5.2 NF-κB/iNOS衍生NO通路参与了 CUMS导致的大鼠结肠组织损伤和体重增长缓慢过程。5.3 CUMS通过激活NF-κB信号通路导致大鼠肠道菌群多样性升高,进而导致肠道菌群失调,大肠埃希菌-志贺氏菌属为CUMS致抑郁大鼠的肠道生物标识菌群。5.4大肠埃希菌干预致肠道菌群失调可导致大鼠焦虑样行为而非抑郁样行为明显增加。5.5大肠埃希菌干预致肠道菌群失调通过NF-κB信号途径影响海马和PFC组织中iNOS衍生NO过度表达,HPA轴持续活化,海马DG区和PFC组织受损,从而引起大鼠行为学改变。