论文部分内容阅读
纳豆激酶(Nattokinase, NK)是由纳豆枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis natto)产生的一种具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶。动物和人体的药物学实验证明,NK具有很强的纤溶活性,生物安全性好,易被人体肠道吸收,溶栓作用直接迅速,酶活半衰期长,并且可以大规模发酵生产,因而成本低廉。我国市场上的NK类保健产品的溶纤活性相当低,一些企业在纳豆生产过程中偷工减料,以次充好使得生产的NK无任何药物学效果甚至具有副作用。因此开发可工业化生产、成本低廉、使用安全、溶栓效果好的NK产品意义重大。本论文对实验室保存的纳豆芽胞杆菌BSN-3菌体进行紫外诱变,通过绘制致死率曲线,确定诱变时间是18s。经过脱脂牛奶平板初筛、福林酚法测酶活复筛、纤维蛋白平板验证的方法筛选出一株高产NK的菌株A10-5。纤维蛋白平板测定NK酶活,菌株A10-5酶活为1139 IU/mL,相比于未诱变菌株提高了0.88倍,遗传稳定性实验证明菌株A10-5产纳豆激酶具有良好的遗传稳定性。A10-5菌株在优化后的木糖为碳源、胰蛋白胨为氮源的培养基中培养72 h的酶活1768 IU/mL,相比于在NB培养基中提高了55.2%。通过对PEG分子量和浓度、盐种类和浓度、载样量、NaCl浓度、体系pH和萃取温度等对纳豆激酶在两相中分配行为进行研究,实验结果表明PEG400/K2HPO4双水相体系萃取纳豆激酶是可行的,最佳萃取条件(质量分数)为：K2HPO4浓度为12%,PEG400的浓度为9%,发酵液的添加量为20%,NaCl的添加量为10%,温度常温,pH不需要调节。将体系放大20倍后,放大体系对纳豆激酶的回收率为93.4%,说明采用该双水相体系从发酵液直接萃取纳豆激酶是可行的。取上相使用超滤膜为10 kDa的超滤离心管进行超滤,加入pH7.4的PBS进行多次超滤,用SDS-PAGE检测分离纯化的纳豆激酶拥有较高的纯化度。实验选取昆明种健康小鼠34只,雌雄各半,按体重随机分为4组进行纳豆激酶药效学实验。第一组作为正常空白对照组灌胃生理盐水,第二组灌胃纳豆激酶粗提液作为模型对照组,第三组灌胃纳豆激酶粗提液,第四组纳豆激酶盐析溶液。连续灌胃10d,每日1次,灌胃量为0.6 mL。除第二组注射生理盐水外,其它各组均在腰背部皮下注射0.4%的0.1 mL/10g老鼠体重的角叉菜胶造血栓模型。实验结果表明纳豆激酶溶液组小鼠的血栓形成长度和相对长度对比NC组明显变短,说明纳豆激酶可应用于血栓治疗。纳豆激酶能明显延长凝血时间,不会使得出血时间延长,并且具有显著地水解体外血凝块的活力。