精子的成熟过程受细胞内蛋白质磷酸化的调控，而蛋白质磷酸化受蛋白激酶(英文全称，PK)和蛋白磷酸酶(英文全称，PP)的双重调控。有关蛋白激酶活性调控对小鼠精子成熟的影响已有许多研究报道，但是蛋白磷酸酶活性及其调控对小鼠精子成熟的研究尚未多见。本研究的目的旨在证明小鼠精子中蛋白磷酸酶的存在及其活性的调控对小鼠精子的影响。采用6～8周龄昆明雄性小鼠为试验材料，用PNPP试剂盒及分光光度法，进行了如下研究。 1．睾丸提取液及精液的容积对蛋白磷酸酶活性的影响。将睾丸(140±10mg/mL)和精子(5～7×10<6>个/mL)用超声破碎仪破碎，提取上清液，分别抽取不同容积的提取液，用于蛋白磷酸酶活性分析。结果显示，小鼠睾丸中存在较高的蛋白磷酸酶活性，随着提取液容积的增加，蛋白磷酸酶的活性显著(P<0.01)升高。小鼠附睾精子中蛋白磷酸酶的活性较低，但随着精子提取液量的增加，蛋白磷酸酶活性显著(P<0.01)升高。根据提取液容积依赖性的酶活性曲线图，将用于酶活性反应的睾丸提取液的量为5ul，精子提取液的量为为20ul。 2．睾丸组织提取液与底物的反应时间对蛋白磷酸酶活性的影响。将睾丸提取液与底物反应的时间设定为0min、10min、15min、30min、1h、1.5h、2h、2.5h、3h，观察反应时间依赖性的酶活性曲线。结果显示，在与底物反应半小时开始，酶活性曲线直线上升，反应两小时候以后酶活性曲线基本达到平衡。因此，酶与底物作用时间区域在0.5～2.0 h之内。对于酶活性较高的提取物可设反应时间为30分钟，酶活性较低的提取物可增加反应时间至1.0 h。 3．睾丸和附睾组织中蛋白磷酸酶活性的比较。采用相同重量(140±10mg/mL)的睾丸、附睾头部和附睾尾部的提取液进行酶活性测定。结果显示，睾丸组织蛋白磷酸酶活性最高，其次是附睾头部，附睾尾部最低，三者之间差异极显著(P<0.01)。 4．睾丸和附睾精子蛋白磷酸酶活性检测。睾丸精子用Percoll梯度浓度分离法分离，附睾精子用浮游方法分离。分离后分别调节浓度，经破碎分离上清液，测定蛋白磷酸酶活性。结果显示，睾丸精子蛋白磷酸酶活性最高，其次是附睾头部精子，附睾尾部精子最低，三者之间差异显著(P<0.01)。 5．睾丸精子蛋白磷酸酶1和蛋白磷酸酶2A活性检测。花萼海绵诱癌素A(calyculin A，CA)和冈田酸(Okadaic acid，OA)是蛋白磷酸酶1(protein phosphatase 1，PP1)和蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)的特异性抑制剂，PP1和PP2A对CA同样敏感，而PP2A对OA的敏感性比PP1高100倍，因此根据不同浓度CA和OA对精子提取液的抑制能力，可以检测精子提取液中PP1或PP2A的含量。分离睾丸精子，经破碎添加CA和OA，检测蛋白磷酸酶活性。结果显示，当CA的浓度增加至1.0 nmol/mL时，能够强烈抑制(84％)蛋白磷酸酶活性，继续增加CA的浓度并没有显著提高抑制效果；当OA的浓度增加1.0 nmol/mL，时几乎不抑制蛋白磷酸酶活性，继续增加OA的量，能够逐渐可抑制蛋白磷酸酶活性，当OA浓度达到1000nmol/mL时，能够强烈抑制蛋白磷酸酶活性(88％)。 6．附睾精子蛋白磷酸酶1和蛋白磷酸酶2A活性检测。分离附睾头部和尾部精子，分别添加1.0 nmol/mL CA和OA，检测蛋白磷酸酶活性结果显示，与未添加对照组比较，无论是附睾头部还是尾部精于，CA添加组都能够显著(P<0.01)抑制蛋白磷酸酶活性(80％)，可是OA添加组仅有微弱的抑制效果。 7．CA和OA对小鼠附睾精子运动能力的调控。采用浮游法分离附睾头部和尾部精子，调节浓度为5～7×10<6>个/mL，添加1.0 nmol/mLCA或1000 nmol/mL OA，在CO<,2>培养箱中孵育10分钟(37℃，5％CO2)，显微镜下观测精子运动能力。结果显示，无论是CA还是OA都能显著(P<0.01)提高附睾头部和尾部精子的运动能力。 上述研究结果表明，小鼠睾丸和附睾精子中存在明显的蛋白磷酸酶活性。特异抑制剂抑制试验证明，酶活性类型主要为蛋白磷酸酶1，这些酶活性随精子的成熟过程递减，通过特异抑制剂调控精子蛋白磷酸酶活性，能够显著提高附睾精子的运动能力，说明蛋白磷酸酶1对精子的功能获得具有重要的调控作用。