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第一部分人生长激素基因表达载体的构建目的:构建表达人生长激素(hGH)基因的重组载体,为实现hGH基因在鼠骨骼肌成肌细胞的表达奠定基础。方法:将目的基因hGH亚克隆到载体pcDNA3.0、pLenti6 / V5-D-TOPO、pLgXSN载体上,构建重组载体pcDNA-hGH、pLenti6/V5-hGH、pLghGHSN,并通过酶切,DNA测序鉴定构建载体是否正确。结果:pcDNA-hGH、pLenti6/V5-hGH、pLghGHSN,三个载体经限制性内切酶分析和DNA测序分析表明:hGH的基因片段和预期相符。结论:表达人生长激素的重组载体pcDNA-hGH、pLenti6/V5-hGH、pLghGHSN构建成功。第二部分组织工程生物人工肌肉分泌和释放重组人生长激素目的:实现人生长激素(hGH)基因在鼠骨骼肌成肌细胞的表达,并将hGH基因修饰的鼠骨骼肌成肌细胞组织工程为生物人工肌肉。方法:(1)建立鼠原代骨骼肌成肌细胞的分离和培养的方法。(2)用pcDNA-hGH转染鼠原代骨骼肌成肌细胞,使用放免的方法检测细胞培养液中hGH的含量,证实pcDNA-hGH转染鼠骨骼肌成肌细胞后能够合成和分泌hGH;(3)用pLenti6/V5- hGH转染人胚肾上皮细胞(293T),blasticidin筛选,收集病毒上清,用高滴度的病毒上清感染鼠原代骨骼肌成肌细胞,使用放免的方法检测成肌细胞培养液中hGH的含量,证实pLenti6/V5-hGH感染鼠骨骼肌成肌细胞后能够合成和分泌hGH;(4)采用二步转染转导法,用E-86和PT67包装细胞包装pLghGHSN, G418筛选,产生稳定的病毒生产细胞线。用高滴度的病毒上清感染鼠原代骨骼肌成肌细胞,使用放免的方法检测成肌细胞培养液中hGH的含量,证实pLghGHSN感染鼠骨骼肌成肌细胞后能够合成和分泌hGH;(5)比较构建的三种载体转染成肌细胞后表达hGH的浓度。用高表达的载体转染成肌细胞,并将hGH基因修饰的鼠骨骼肌成肌细胞组织工程为生物人工肌肉,用放射免疫和免疫印迹的方法检测生物人工肌肉的培养基中hGH的表达,验证基因修饰的生物人工肌肉是否能够合成和分泌hGH。结果:(1)建立了鼠原代骨骼肌成肌细胞的分离和培养的方法。(2)三种载体转染成肌细胞后,hGH的表达浓度分别是:40.41±0.1 ng/L; 58.58±3.31ng/ml;680.58±3.31ng/ml。转染pLghGHSN的成肌细胞表达hGH的浓度最高。(3)用pLghGHSN转染鼠骨骼肌成肌细胞,并将hGH基因修饰的鼠骨骼肌成肌细胞组织工程为生物人工肌肉,用放免的方法检测到生物人工肌肉分泌hGH的量为1-2μg/BAM /24h,免疫印迹检测生物人工肌肉分泌的hGH蛋白分子量为22KDa。结论: pcDNA-hGH、pLenti6/V5-hGH、pLghGHSN转染成肌细胞后可以在成肌细胞有效表达hGH。pLghGHSN转染成肌细胞后表达hGH的浓度最高。hGH基因修饰的生物人工肌肉能够合成和分泌hGH。第三部分组织工程生物人工肌肉释放重组人生长激素对心肌梗死大鼠心功能的影响目的:将人生长激素(hGH)基因修饰的生物人工肌肉(BAM)植入心肌梗死大鼠的皮下,观察hGH基因表达和释放对心肌梗死大鼠心功能的影响。方法:(1)24只SD大鼠随机分为两组,心肌梗死组12只,假手术组12只。(2)心肌梗死组大鼠结扎冠状动脉前降支,建立鼠心肌梗死模型。假手术组只穿线,不结扎。(3)心肌梗死组随机分为治疗组(MI-GH组)和对照组(MI组),假手术组随机分为治疗组(S-GH组)和对照组(S组),结扎冠状动脉的前降支术后及假手术后即刻将基因修饰的BAM植入同种动物的皮下,治疗组植入GH-BAM,对照组植入GFP-BAM。(4)分别于皮下植入生物人工肌肉4周和8周后,用放免的方法检测大鼠血清中hGH和IGF-1的含量,(5)皮下植入生物人工肌肉8周后,用超声心动图检测各组大鼠EF、FS、LVEDD。结果:(1)分别于4w和8w后用放免的方法检测血清中hGH的浓度:MI-GH组和S-GH组血清hGH和IGF-1的浓度显著高于相应的对照组, P<0.05。(2)8w后超声心动图检测结果:①EF:MI-GH组(65.0±6.5%)与MI组(48.1±6.8%)比较:P<0.05,S-GH组与S组比较:P>0.05;②FS:MI-GH组(41.3±7.4%)与MI组(26.5±7.1 %)比较:P<0.05。S-GH组与S组比较P>0.05;③LVEDD:MI-GH组(7.2±0.42)与MI组(8.25±0.31)比较:P<0.05。S-GH组与S组比较:P>0.05。结论:(1) hGH基因修饰的生物人工肌肉植入同种动物的皮下后,能够在心肌梗死大鼠体内持续稳定地分泌和释放hGH,并改善心肌梗死大鼠的心功能。(2)基因修饰的生物人工肌肉可能作为一种新的基因治疗方法来调节性补充有生物活性的治疗性蛋白质,纠正某些疾病伴随的神经内分泌失衡状态。