论文部分内容阅读
实验目的:作为常见的消化道恶性肿瘤,食管鳞癌在全世界范围有着高发病率兼死亡率。患者确诊时往往在中晚期,预后差,五年生存率低,且他们通常要承受化疗药物带来的毒副反应。本课题组近年来合成的化合物TZY2与TZY是抗肿瘤活性比较好的萘酰亚胺-多胺缀合物。本课题将人源性食管鳞癌细胞KYSE-30、KYSE-150、EC-9706作为主要研究对象,探究化合物TZY2与TZY抑制食管鳞癌的作用和机制。实验方法:采用MTT法和CCK-8法检测化合物TZY2与TZY作用下食管鳞癌细胞的生存率;采用食管鳞癌细胞的平板克隆实验,观察TZY2作用下细胞的集落形成;使用倒置荧光显微镜检测化合物TZY2与TZY在食管鳞癌细胞中是否具有荧光并观察TZY2与TZY的荧光强度;在激光共聚焦显微镜下采集化合物TZY2与TZY在食管鳞癌细胞中的荧光成像;使用高内涵成像系统,检测TZY2与TZY在食管鳞癌细胞中的荧光值;采用Lyso-Tracker Red、Golgi-Tracker Red、ER-Tracker Red等染料标记在化合物作用下的食管鳞癌细胞,并在共聚焦显微镜下分析化合物与细胞器的共定位,以及检测化合物TZY2与TZY对食管鳞癌细胞中溶酶体的影响;采用DND-189溶酶体荧光探针对细胞进行染色,高内涵成像系统上检测食管鳞癌细胞中的荧光强度;通过Trypan blue染色观察化合物作用下食管鳞癌细胞被染色的情况;使用Caspase-3活性检测试剂盒染色后观察化合物作用下的食管鳞癌细胞,并通过荧光显微镜检测细胞中的荧光情况;化合物作用食管鳞癌细胞后,用AnnexinⅤ与PI染料染色细胞,之后在流式细胞仪上分析其凋亡情况;使用Rh123染料染色,检测在化合物作用下食管鳞癌细胞线粒体跨膜电位的变化;使用MDC染料染色食管鳞癌细胞,然后在流式仪检测化合物作用下食管鳞癌细胞中的荧光强度;加入H+-ATP酶抑制剂巴弗洛霉素(Baf-A1)处理食管鳞癌细胞,用MTT法和台盼蓝染色法检测细胞的存活情况;采用划痕实验研究化合物对食管鳞癌细胞不同时间点迁移的作用;采用Western blot检测化合物作用下KYSE-30、KYSE-150及EC-9706细胞中凋亡相关蛋白、溶酶体相关蛋白以及自噬相关蛋白的表达水平。实验结果:1.化合物TZY2与TZY抑制食管鳞癌细胞存活。MTT实验和CCK-8实验结果显示化合物TZY2与TZY抑制食管鳞癌细胞KYSE-30、KYSE-150、EC-9706的存活,且效果随浓度、时间的增加而加强。同化合物TZY相比,化合物TZY2对食管鳞癌细胞的抑制效果更强。克隆形成实验中化合物TZY2可抑制食管鳞癌细胞集落形成。2.化合物TZY2与TZY在食管鳞癌细胞中兼具蓝色荧光和绿色荧光,同化合物TZY相比,化合物TZY2的蓝色荧光值和绿色荧光值较强。3.化合物TZY2与TZY靶向食管鳞癌细胞中的溶酶体并对溶酶体产生影响。Lyso-Tracker Red、Golgi-Tracker Red、ER-Tracker Red染色显示,TZY2与TZY荧光在食管鳞癌中与溶酶体荧光重合,化合物的靶向部位为溶酶体,对溶酶体的位置和体积都产生影响,溶酶体由弥散变聚集呈点状,体积增大。且较之TZY,TZY2的作用更明显;DND-189溶酶体探针染色显示,加入化合物TZY2后食管鳞癌细胞中荧光增强,p H降低。4.化合物TZY2诱导食管鳞癌细胞发生凋亡。Trypan blue染色显示当化合物浓度增高,食管鳞癌细胞中被染成蓝色的数目越多;AnnexinⅤ和PI染色实验中,发现在TZY2作用下KYSE-30、KYSE-150、EC-9706细胞均发生了凋亡;采用Caspase-3活性检测试剂盒染色发现在化合物作用下,食管鳞癌细胞中荧光随化合物浓度增加而增强。5.Rh123染色检测化合物TZY2可以引起食管鳞癌细胞线粒体膜电位的下降。6.TZY2诱导食管鳞癌细胞发生自噬。MDC荧光染料染色显示化合物作用后食管鳞癌细胞中荧光增强,自噬体数量增多发生自噬;加入Baf-A1后食管鳞癌细胞生存率提高。7.划痕实验中,加入化合物TZY2作用后,食管鳞癌细胞迁移受到了抑制。8.Western blot实验中,加入化合物TZY2作用后细胞中凋亡相关蛋白PARP被剪切,cleaved-PARP表达上调,p21表达增加;自噬相关蛋白Beclin1上调,p62蛋白表达下调,LC3-II/LC3-I的值增加;溶酶体相关蛋白LAMP1与LMAP2表达上调,pro-Cathepsins D表达上调并mature-Cathepsins D表达下调,pro-Cathepsins L表达上调并mature-Cathepsins L表达下调。实验结论:TZY2和TZY在食管鳞癌细胞中均呈现蓝色荧光与绿色荧光,TZY2的荧光更加明显。TZY2和TZY靶向溶酶体,影响溶酶体功能。萘酰亚胺-多胺缀合物TZY2与TZY均能抑制食管鳞癌细胞增殖,且同等条件下化合物TZY2的效果优于化合物TZY。TZY2诱导食管鳞癌细胞凋亡及自噬,并抑制食管鳞癌细胞的迁移。TZY2调节细胞凋亡、自噬和溶酶体相关蛋白的表达。