论文部分内容阅读
研究背景病理性血管新生是肿瘤及其他多种疾病发生发展过程中的标志性环节,血管内皮细胞生长因子VEGF是目前已知的最强促血管新生的分子,自上世纪80年代VEGF被发现,多种以VEGF及其受体VEGFR为靶点的抗肿瘤药物得以研发问世,但面临广泛的耐药、副作用等问题,因此探寻新的靶点以达到治疗肿瘤的目的具有十分重大的意义。孤核受体TR3/Nur77(人TR3;小鼠Nur77;大鼠NGFI-B)是转录因子孤核受体IV亚家族中的一员,被证实在VEGF介导的血管新生中发挥关键作用,课题组前期研究发现降低TR3/Nur77的表达可以显著抑制肿瘤血管新生及肿瘤生长,提示TR3/Nur77可用为新的抗肿瘤治疗的潜在靶点。TR3/Nur77有三个主要功能域:配体结合域(ligand binding domain,LBD)、DNA结合域(DNA binding domain,DBD)、转录激活域(transactivation domain,TAD)。课题组前期研究发现TR3/Nur77对VEGF介导的血管新生的促进作用与其转录活性有关,但其影响VEGF介导的血管新生的具体作用机制尚未得到阐明,以TR3/Nur77及其相关分子为靶点的潜在治疗手段也未得以充分探究,是以本研究通过构建了TR3/Nur77的4个衍生分子以进一步探究TR3/Nur77作用于VEGF介导的血管新生的作用位点及机制,为今后以TR3/Nur77为靶点研发新的抗肿瘤治疗手段提供理论依据。研究目的 验证TR3/Nur77在VEGF介导的血管新生中的作用,探究其影响VEGF介导的血管新生的作用位点及机制,通过研究TR3/Nur77相关的衍生分子在VEGF介导的血管新生中的作用进一步明确TR3/Nur77作为抗肿瘤治疗靶点的潜在价值。研究方法1.选取人黑色素瘤及结直肠癌肿瘤及癌旁组织切片进行免疫组化及免疫荧光染色,观察比较肿瘤及癌旁组织中TR3/Nur77的表达情况;2.向TR3/Nur77基因敲除小鼠及对照组野生型小鼠接种小鼠肺癌LLC细胞系,观察对比肿瘤生长情况;3.向TR3/Nur77基因敲除小鼠及对照组野生型小鼠接种小鼠结肠癌CMT93细胞系,观察对比肿瘤肺部转移情况;4.向内皮细胞高表达TR3/Nur77的EC-Nur77-S转基因小鼠、内皮细胞低表达TR3/Nur77的EC-Nur77-DN转基因小鼠、同品系的野生型wild type小鼠接种小鼠肺癌LAP0297细胞系,观察对比肿瘤生长情况;5.分别构建只表达TR3/Nur77的转录激活域TAD和DNA结合域DBD的重组腺病毒载体F-TR3-M1、F-TR3-M3p(穿梭质粒p ENTR1A,骨架质粒p Ad/CMV/V5-DEST);以及构建针对人TR3基因的sh RNA腺病毒载体sh TR3-176和小鼠Nur77基因的sh RNA腺病毒载体sh TR3-297(穿梭质粒p LKO.1-puro,骨架质粒p Ad/PL-DEST);6.重组腺病毒制备:将构建完成的腺病毒载体感染HEK293细胞,扩增、收集、纯化后得到重组腺病毒悬液,分装冻存;7.重组腺病毒感染内皮及肿瘤细胞,western-blot验证目的蛋白的表达;8.单层细胞划痕试验检测细胞感染重组腺病毒后的迁移能力变化;9.CCK-8细胞增殖试验检测细胞感染重组腺病毒后的增殖能力变化;10.VEGF促血管新生实验:小鼠耳部皮下注射重组腺病毒观察其对血管新生的影响;11.裸鼠接种人黑色素瘤细胞建立移植瘤模型,给不同组荷瘤小鼠分别尾静脉注射不同重组腺病毒观察其对肿瘤生长的影响;12.观察周期结束后处死小鼠取肿瘤、肿瘤周围皮肤、肝脏等组织进行免疫组化检测并提取RNA进行q PCR检测分析组织中TR3/Nur77及其他血管新生相关分子的表达情况;实验结果1.TR3/Nur77在人黑色素瘤及结直肠癌中检测到高表达,但在癌旁组织中不表达;2.接种LLC肺癌细胞后,TR3/Nur77基因敲除小鼠相比于对照组野生型小鼠,肿瘤生长速度及肿瘤大小明显降低;3.接种CMT93结肠癌细胞系后,TR3/Nur77基因敲除小鼠均未出现肺部转移,而对照组小鼠均出现肿瘤肺部转移;4.接种LAP0297肺癌细胞后,相对于野生型小鼠,EC-Nur77-S组小鼠肿瘤大小及重量明显升高;而EC-Nur77-DN组小鼠肿瘤大小及重量明显降低;5.在细胞实验中F-TR3-M1、F-TR3-M3p、sh TR3-176、sh TR3-297可抑制HUVEC内皮细胞及A375肿瘤细胞的增殖与迁移;6.F-TR3-M1、F-TR3-M3p、sh TR3-176、sh TR3-297可抑制VEGF促进的小鼠耳部血管新生;7.F-TR3-M1、F-TR3-M3p、sh TR3-176、sh TR3-297抑制肿瘤生长;8.F-TR3-M1、F-TR3-M3p、sh TR3-176、sh TR3-297抑制肿瘤周边皮肤血管新生;9.F-TR3-M1、F-TR3-M3p、sh TR3-176、sh TR3-297下调血管新生相关分子的表达。结论本研究通过检测对比人肿瘤及癌旁组织中TR3/Nur77的表达、对比TR3/Nur77基因敲除小鼠及TR3/Nur77转基因小鼠(内皮细胞高表达和低表达TR3/Nur77的小鼠)的肿瘤生长转移情况、构建TR3/Nur77的衍生分子进一步探究其作用于VEGF介导的血管新生的机制及作为肿瘤治疗靶点的具体位点等一系列研究,得出以下结论:TR3/Nur77高表达于肿瘤组织中,癌旁组织中未检测到表达;TR3/Nur77能调节肿瘤的生长及转移,对肿瘤细胞本身及肿瘤微环境均产生影响;TR3/Nur77的4个衍生分子F-TR3-M1、F-TR3-M3p、sh TR3-176、sh TR3-297抑制内皮细胞的增殖与迁移、抑制VEGF促进的血管新生、抑制小鼠黑色素瘤生长及肿瘤的血管新生。