低能离子注入黄曲霉甾体转化株诱变选育色素突变体的研究

来源 :安徽农业大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:aoli668
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在现代生物医药产业中,甾体类化合物的生物修饰是生物转化技术的热点领域之一,有着巨大的经济效益和社会效益。本研究涉及的黄曲霉甾体转化株,具有很强的甾体C11位α-羟基化能力,但是该菌种在发酵的过程中会产生一种红色色素,用常规的方法难以去除,从而影响到产物的分离与纯化。本研究利用低能离子对黄曲霉甾体转化株进行诱变,研究了离子束诱发色素突变适宜的技术参数,进行了色素突变体的筛选和突变体遗传稳定性分析,利用RAPD技术初步分析了色素突变体的变异,获得如下主要结果: 1.低能离子注入黄曲霉孢子后,呈现出一种先降后升再降的“马鞍型”剂量存活曲线;在相同的能量和剂量下,质量数越大的离子,菌株的存活率也越低;N+注入的平均突变率明显高于Ar+。出发菌株最适的注入离子为N+,最适的注入能量为10keV、注入剂量为1.56×1015ions/cm2~2.08×1015ions/cm2。 2.经过两轮筛选,选育出不产红色素的突变菌株AF-NR。与出发菌株相比,在λ=395nm处的吸光度有了明显的降低。对该菌株进行了进一步的纯化和传代实验,结果表明该菌株在遗传性状上表现稳定。同时,甾体转化率的薄层层析估测表明,低能离子注入没有明显影响到该菌株的羟化能力。 3.选用102条随机引物对出发菌株和突变菌株的基因组DNA进行了RAPD比较分析。结果显示:76条引物在两池具有扩增产物,其中8条引物在两池间表现有多态性,有多态性扩增的引物频率为7.85%,表明离子注入诱发了出发菌株基因组DNA分子的变异。将随机引物S96、S382、S388扩增出的差异性片段克隆后测序,发现随机引物S96扩增所得差异性片段与AspergillusfumigatusAf293hypotheticalprotein(Afu6g02340)的部分mRNA有很高的同源性,而S382扩增所得差异性片段与烟曲霉3-异丙基苹果酸脱氢酶的部分mRNA和AspergillusnidulansFGSCA4hypotheticalprotein(AN5886.2),mRNA有很高的同源性,其意义还有待于进一步的研究。 4.初步研究了发酵条件对发酵过程中红色素生成的影响:发现发酵时间的长短对于色素的生成影响较大,而培养温度、接种量、底物浓度则对色素的生成影响不大。
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