研究背景：细胞过继免疫治疗被认为是继手术、化疗、放疗之后的肿瘤重要治疗手段。近年来的基础和临床研究证明,细胞过继免疫治疗能够与传统的肿瘤治疗方式协同作用发挥持续的抗肿瘤效应,预防肿瘤复发转移。然而,仍存在免疫细胞难以到达肿瘤局部、免疫耐受、肿瘤免疫抑制微环境等问题限制肿瘤细胞过继免疫治疗的效果。人γδT细胞是一类进化上保守的非MHC限制性的固有T淋巴细胞,因其TCR受体δ链的不同分为V61γδ6T(Vδ1T)和Vγ9Vδ2γδT(Vδ2T)两种主要细胞亚型。生理情况下,Vδ2T细胞是人外周血γδT细胞的主要亚群,能在体外杀伤多种来源的肿瘤细胞。由于Vδ2亚群细胞数量多,体外激活扩增方法成熟,目前基于肿瘤的γδT细胞过继免疫治疗的临床试验主要集中在Vδ2T细胞亚群,但其存在体内抗肿瘤能力难以持久、对实体肿瘤的效果欠佳等不足。人Vδ1T细胞主要分布于肠道上皮、皮肤、脾脏和肝脏,在外周血中所占比例很低。最近,Vδ1T细胞被证明能够体外清除血液系统肿瘤细胞和实体肿瘤尤其是上皮来源肿瘤细胞,也能在体外培养扩增。激活的Vδ1T细胞能在血循环中持续发挥抗肿瘤效应,有望成为肿瘤的细胞过继免疫治疗的候选细胞亚群。然而人外周血Vδ1和Vδ2T细胞的肿瘤杀伤作用哪个更强、能否杀伤肿瘤干细胞以及如何体外激活扩增获得大量高纯度Vδ1T细胞等尚不清楚。我们试图以结肠癌为例研究γδT细胞在肿瘤过继免疫治疗中的作用及机制。研究方法：为了明确自然状态下人外周血γδT细胞的特征及肿瘤杀伤作用,我们首先通过原代外周血淋巴细胞分离及流式细胞检测分析健康人外周血中Vδ1和Vδ2T细胞分别占总γδT细胞的比例、CD69的表达水平、细胞表型、细胞因子分泌及趋化因子受体表达等；然后通过结肠癌细胞低血清培养技术获得干细胞样克隆球细胞并对其干细胞特性包括克隆球形态、干细胞相关基因表达、成瘤能力等进行鉴定;最后通过流式细胞分选技术分离V61和Vδ2T细胞亚群,分别与结肠癌细胞及其克隆球细胞短期共培养,流式细胞检测比较结肠癌细胞及其克隆球细胞凋亡情况。为了研究Vδ1T细胞体外扩增方法及其杀伤肿瘤的机制,我们首先磁珠分选出人外周血总γδT细胞,通过PHA+IL-7体外短期培养扩增14天,流式细胞检测分析Vδ1T细胞体外培养前后在总γδT细胞中所占的比例并用CFSE法分析其增殖水平；然后用流式细胞检测分析扩增后Vδ1和Vδ2T细胞表型、细胞因子分泌、趋化因子受体表达情况；同时通过流式细胞分选技术分离Vδ1和V62T细胞亚群分别与结肠癌细胞及其克隆球细胞短期共培养,流式细胞检测比较结肠癌细胞及其克隆球细胞凋亡情况；为了明确Vδ1T细胞的肿瘤杀伤机制,我们通过transwell共培养的方法分析Vδ1T细胞体外杀伤肿瘤细胞的方式；然后通过流式细胞检测分析Vδ1T细胞及肿瘤细胞表面细胞毒作用相关分子受体及配体表达情况；最后通过细胞毒作用相关分子阻断抗体验证Vδ1T细胞体外杀伤肿瘤的途径。为了阐明Vδ1T细胞体系扩增及其体内抗肿瘤效应优势,首先我们将PHA+IL-7扩增的总γδT和V61T细胞与传统Zol+IL-2方法扩增后的总yδT和V62T细胞、PHA+IL-2扩增的总γδT和Vδ1T细胞的体外杀伤肿瘤效应进行比较；为了解释PHA+IL-7促进Vδ1T细胞增殖和存活的优势,我们比较了PHA+IL-7和PHA+IL-2两种扩增方法中V61T细胞的增殖及存活情况；然后通过ELISA方法检测了两种扩增体系中IL-2的分泌量；接着通过IL-2和IL-7中和抗体分析其对Vδ1T细胞增殖和凋亡的影响。最后通过建立人结肠癌NOD/SCID小鼠移植瘤模型验证Vδ1T细胞体内抗肿瘤效应。研究结果：1.人新鲜外周血yδT细胞亚群的特征及肿瘤(干)细胞杀伤作用。自然状态下健康人外周血γδT细胞以Vδ2T细胞亚群为主,Vδ1T细胞比例仅占1%-10%。人新鲜外周血Vδ1亚群表面细胞活性标记CD69的表达高于Vδ2亚群。此外,Vδ1T细胞高表达CD107a、Perforin、GranzymeB、TRAIL、CD57和HLA-DR,而Vδ2T细胞高表达DNAM-1、CD56、TNF-a和IFN-γ。与Vδ2T细胞比较,Vδ1T细胞还高表达CCR4、CCR6、CCR7、CXCR1、CXCR5和CXCR7。其他细胞表面标记和细胞因子分泌未见明显差异。新鲜外周血Vδ1和Vδ2T细胞流式分选纯度大于90%。低血清条件下培养结肠癌细胞14天后细胞显示干细胞相关特性,如具有克隆球形态,高表达肿瘤干细胞相关基因,小鼠体内成瘤能力增强。细胞毒作用实验显示,在同样的效应细胞／靶细胞比例下,健康人外周血Vδ1T细胞较同一样本配对的Vδ2T细胞能够杀伤更多的结肠癌细胞及相应克隆球细胞。同样地,结肠癌病人外周血Vδ1T细胞对结肠癌细胞也具有较Vδ2T细胞更强的杀伤作用。2.Vδ1T细胞体外扩增体系的构建及其杀伤肿瘤的机制。磁珠分选γδT细胞纯度大于90%,经体外PHA+IL-7培养14天后,Vδ1T细胞被选择性富集扩增,在γδT细胞中所占比例从约10%提高到80%左右,而Vδ2T细胞比例显著下降。PHA+IL-7能明显诱导健康人和结肠癌病人外周血来源的Vδ1T细胞增殖,而非Vδ2T细胞。PHA+IL-7扩增后的Vδ1T细胞高表达CD107a、 GranzymeB、FasL、TRAIL、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD57、LFA-1、 HLA-DR、CD86、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CXCR1、CXCR2、CXCR3、 CXCR5和CXCR7,而扩增后的Vδ2T细胞高表达CD56、CCR1、CCR2、CCR6、 CX3CR1、CXCR4和CXCR6.有趣的是,共抑制分子CTLA-4和PD-1在PHA+IL-7扩增后的Vδ2T细胞上高表达,而在Vδδ1T细胞上的表达较低。胞内细胞因子检测显示,PHA+IL-7扩增后的Vδ1T细胞分泌大量IL-lα、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-21和GM-CSF,而Vδ2T细胞分泌较多TNF-a、IL-4和IFN-γ。和我们先前在人结肠癌组织中的研究相反,无论是扩增后的Vδ1T细胞还是Vδ2T细胞,均不分泌IL-1β、IL-17、IL-22和IL-12/23。值得注意的是,GranzymeB、Perforin、FasL、 TRAIL、NKG2D、LFA-1、NKp30、NKp44和NKp46在PHA+IL-7扩增后的Vδ1T细胞表达程度远远高于自然状态。细胞毒作用实验显示,在同样的效应细胞／靶细胞比例下,健康人和结肠癌病人外周血来源的Vδδ1T细胞经PHA+IL-7扩增后均较Vδ2T细胞能够杀伤更多的结肠癌细胞。此外,PHA+IL-7扩增后的Vδ1T细胞的肿瘤杀伤能力较自然状态显著增强。在Vδ1T细胞与结肠癌细胞及其克隆球细胞transwell共培养体系中,我们发现Vδ1T细胞的肿瘤细胞杀伤作用明显降低。结肠癌细胞及其克隆球细胞表面不同程度高表达Fas、DR4、DR5、MICA/B、和ICAM-1,而PHA+IL-7扩增后的Vδ1T细胞高表达FasL、TRAIL、NKG2D、NKp30和LFA-1等上述分子相应受体或配体。细胞毒作用实验中用FasL、TRAIL、NKG2D、NKp30和LFA-1抗体阻断后Vδ1T细胞的肿瘤杀伤作用被显著抑制。3.Vδ1T细胞体系扩增及其体内抗肿瘤效应优势。通过细胞毒作用实验,我们发现PHA+IL-7扩增的总γδT及Vδ1T细胞的肿瘤杀伤作用强于Zol+IL-2扩增的总γδ T及Vδ2T细胞和PHA+IL-2扩增的总γδT及Vδ1T细胞。我们拆分扩增体系中各种因子单独检测其对Vδl T细胞的增殖和存活的影响。我们发现,PHA、PHA+IL-2、PHA+IL-2+IL-7均能高效扩增Vδ1T细胞。然而,PHA+IL-7组合更能高效扩增Vδ1T细胞而且凋亡细胞数量最少。PHA+IL-7扩增至21天,V31T细胞数量从起始的1×105扩增至1.2×107,增加100多倍,扩增效率显著高于PHA+IL-2。与PHA+IL-2相比,PHA+IL-7更有效诱导Vδ1T细胞增殖并减少其凋亡,且能刺激Vδ1T细胞自分泌IL-2。此外,Vδ1T细胞增殖和存活能被IL-2和IL-7中和抗体显著抑制。为了验证PHA+IL-7扩增后的V61T细胞体内抗肿瘤效应,我们用人结肠癌细胞系HT29建立了人结肠癌NOD/SCID小鼠移植瘤模型。组织H&E染色显示小鼠移植瘤和人结肠癌具有相似的组织病理学特征。我们发现,PHA+IL-7扩增后的总γδT细胞治疗组小鼠移植瘤的生长明显受到抑制且生存时间延长,而Zol+IL-2扩增后的总,γδT细胞治疗组小鼠移植瘤的生长及生存时间与对照组没有统计学差异。进一步分离PHA+IL-7扩增后的Vδ1T细胞和Zol+IL-2扩增后的Vδ2T细胞治疗移植瘤小鼠得到相似的结果。通过免疫荧光染色在移植瘤内能够清楚的看到肿瘤浸润人CD45细胞。移植瘤小鼠外周血和脾脏流式细胞检测发现均有人CD45阳性细胞。结论：我们的研究首次证明了自然状态下健康人和结肠癌病人外周血分离的Vδ1T细胞比Vδ2T细胞具有更强的人结肠癌细胞杀伤作用。我们建立了更优的体系扩增健康人和结肠癌病人外周血来源的Vδ1T细胞,PHA+IL-7扩增的Vδ1T细胞有更强的结肠癌细胞及克隆球细胞杀伤作用。机制上,Vδ1T细胞通过细胞-细胞接触依赖和细胞毒作用相关受体-配体相互作用的方式来杀伤结肠癌细胞及克隆球细胞。PHA+IL-7通过诱导Vδ1T细胞自分泌IL-2的方式促进其增殖和存活。最终,体内验证了PHA+IL-7扩增的Vδ1T细胞能明显抑制人结肠癌移植瘤小鼠的肿瘤生长并延长小鼠生存时间。总之,我们的研究发现了更有效的Vδ1T细胞激活扩增体系,证明了人外周血Vδ1T细胞功能亚群比Vδ2T细胞具有更强的结肠癌细胞及克隆球细胞杀伤潜能,由此为人实体瘤的细胞过继免疫治疗提供了新的思路。