纳米材料可以穿透血脑屏障、血眼屏障及血睾屏障，从而可能危害到生物体的安全。研究表明纳米材料可以在细胞水平、亚细胞水平、基因、蛋白水平及整体动物水平对生物体产生影响。与同种物质微米级的颗粒比较，一般纳米颗粒的生物活性更强，对机体的潜在危害也可能更大。　　 2009年9月北京朝阳医院宋玉果的研究团队在《欧洲呼吸病学杂志》(Eur Respir J2009，34(3)：559)上发表了题为《暴露于纳米颗粒环境中可能造成胸腔积液、肺纤维化和肉芽肿》的论文，首次报告了纳米颗粒致人死亡的案例。引起了欧美多国专家的热议和质疑，《Nature》也在线发表了一篇社论文章关注此事。该研究把关于纳米技术的健康风险的争论推上了新的高潮，纳米颗粒能否损伤肺组织也激起了热烈的讨论。　　 纳米SiO2作为纳米材料家族中的重要一员，是目前世界上大规模工业化生产的产量最高的一种纳米粉体材料，其产品己广泛应用于电子封装材料、高分子复合材料、塑料、涂料、橡胶改性、颜料、陶瓷、胶粘剂、玻璃钢、药物与基因传递复合载体、生物传感器、化妆品及抗菌材料等几乎涉及微米SiO2粉体的所有领域。随着纳米SiO2应用领域的拓宽，研究者、生产者和消费者经呼吸道、口和皮肤等途径接触的机会和水平不断增加。因其生物安全性尚不确定，所以该方面的研究也是各国学者、有关管理部门及社会公众的广泛关注的热点。　　 众所周知以石英为代表的微米SiO2是典型的肺毒物，可引起矽肺和肺癌。在我国已有累计超过60万的矽肺病人，每年还在以新发1万多例的病例数增长，与之有相同化学组分的纳米SiO2是否具有与石英一样的毒性?为避免重蹈微米SiO2严重危害劳动者健康的覆辙，开展纳米SiO2的肺毒性研究将十分必要。　　 本研究以微米SiO2为阳性对照，通过体外培养巨噬细胞染尘及体内经气管灌注大鼠染尘的方法，从细胞和整体动物两个水平研究纳米SiO2的肺毒性作用并探讨其机制，为充分认识和评价纳米SiO2的安全性、科学生产和应用及今后制订防护标准等诸多方面提供基础毒理学资料。实验结果如下：　　 1．应用MTT法测定纳米和微米SiO2粒子对RAW264.7细胞染毒24h的IC50分别为5.08mg/m1和16.69mg/ml;纳米和微米SiO2在31.25～8000μg/ml剂量范围内，对RAW264.7细胞染毒8h、16h、24h、32h、40h、48h、56h、64h和72h后，细胞活力降低，呈现剂量和时间-效应关系，500、2000、8000μg/ml纳米SiO2染毒组细胞的生长曲线较同剂量微米SiO2降低得更早、更明显，RT-CES系统和MTT法在评定细胞毒性方面具有较好的一致性；光学和荧光显微镜下观察到500μg/ml纳米及微米SiO2可致贴壁细胞数量减少、体积增大、呈气球样变，纳米SiO2染毒后，贴壁细胞数量减少更明显，细胞形态趋于不规则形，部分细胞开始崩解。透射电镜下观察到微米SiO2粒子染毒RAW264.7细胞内线粒体肿胀、嵴断裂、胞质内空泡增多，纳米SiO2引起上述细胞超微结构异常改变的程度较微米SiO2重，且细胞染色质固缩，细胞核呈致密浓染。能谱仪分析显示染毒细胞超微结构中吞噬泡内的颗粒和细胞间隙的颗粒均含有Si元素。　　 利用丙酮酸法测定125、250、500μg/ml纳米及微米SiO2染毒RAW264.7细胞培养液中LDH活性显著升高，呈时间-效应关系，三个剂量的纳米SiO2染毒组RAW264.7细胞培养液中LDH含量高于微米SiO2(P＜0.05);应用FRAP技术，经激光扫描共聚焦显微镜检测125、500μg/ml纳米SiO2与500μg/ml微米SiO2组细胞膜荧光恢复率及细胞膜扩散系数低于阴性对照组，500μg/ml纳米SiO2组及微米SiO2组的细胞膜荧光恢复率和细胞膜扩散系数差异无统计学意义；经Ca2+敏感探针Fluo-3/AM与激光扫描共聚焦显微镜结合检测125、500μg/ml纳米SiO2组与500μg/ml微米SiO2细胞内[Ca2+]j含量在100s、200s、300s、400s、500s和600s的各作用时间点均高于阴性对照组，500μg/ml纳米SiO2组及微米SiO2组的细胞内[Ca2+]i含量差异无统计学意义；500μg/ml纳米与微米SiO2染毒RAW264.724h用Hoechst33258荧光染色和Annexin V-PI双染法均可见调亡细胞，125、500μg/ml纳米SiO2及500μg/ml微米SiO2粒子致RAW264.7细胞凋亡率高于阴性对照组；运用PI染色流式细胞仪测定125μg/ml纳米SiO2粒子致细胞增殖指数降低及G0/G1期细胞增多，500μg/ml纳米SiO2粒子及微米SiO2致细胞增殖指数降低及G0/G1期、S期细胞增多，500μg/ml纳米SiO2组及微米SiO2组细胞凋亡、细胞增殖指数及各周期分布情况差异无统计学意义；细胞内脂质过氧化测定结果显示，500μg/ml纳米SiO2粒子及微米SiO2染毒细胞内MDA，H2O2，·OH，O2·ˉ，NO水平显著升高，纳米SiO2染毒细胞O2·水平高于微米SiO2;DCFH-DA荧光探针与激光扫描共聚焦显微镜结合测定125μg/ml、500μg/ml纳米SiO2及500μg/ml微米SiO2可致细胞内ROS水平升高，呈现时间-效应关系，500μg/ml纳米SiO2组所致细胞内ROS水平高于同剂量微米SiO2组。提示与微米SiO2化学组成相同的纳米SiO2具有与其相似的细胞毒性作用，由于粒径小，表面大量羟自由基的存在，作用于巨噬细胞后引发呼吸爆发，产生大量ROS，参与细胞膜的脂质过氧化反应，产生大量自由基，这些自由基以各种方式攻击细胞膜，导致细胞膜流动性下降，细胞膜对LDH的通透性增高，细胞内外离子交换障碍，细胞内钙超载，细胞发生凋亡，增殖周期出现异常，从而引起细胞损伤，纳米SiO2的细胞毒性较微米SiO2强。　　 2.125μg/ml、500μg/ml纳米SiO2及500μg/ml微米SiO2可致RAW264.7细胞培养上清液中TNF-α、TGF-β1及IL-1β的生成量增加，500μg/ml纳米SiO2与微米SiO2致上述细胞因子生成量无差别，500μg/ml纳米SiO2组MMP-2阳性表达率高于同浓度微米SiO2组；RAW264.7细胞在以上浓度纳米SiO2及微米SiO2染毒24h后，培养上清液诱导CHL细胞增殖率、产生羟脯氨酸的量及MMP-2阳性表达率较阴性对照组增加，500μg/ml纳米SiO2组的CHL细胞增殖率与相同浓度微米SiO2组无差别，而产生羟脯氨酸的含量及MMP-2阳性表达率高于相同浓度微米SiO2组；随纳米SiO2染毒浓度的增加，RAW264.7细胞生成细胞因子TNF-α、TGF-β1及IL-1β的量及CHL细胞增殖率、生成羟脯氨酸的量、MMP-2阳性表达率升高。说明纳米SiO2在介导AMs方面具有与微米SiO2一样的作用，即激活AMs，通过细胞因子网络使FB增殖及胶原合成与分泌增加，同时促进CHL细胞MMP-2高表达，不断降解细胞外基质，参与肺泡基底膜损伤，从而启动肺组织纤维化的发生。　　 3．采用一次性气管灌注方式，以50mg/ml的剂量对雄性Wistar大鼠进行纳米和微米SiO2灌注1ml染尘，24h内纳米SiO2染尘组大鼠因肺水肿而陆续死亡，而微米SiO2在急性毒性的观察期7天内未见异常反应，故本实验以25mg/ml为最高剂量一次灌注大鼠1ml，染尘30天后发现25mg/ml微米和纳米SiO2组双肺肿大，肺组织脏器系数较对照组及6.25、12.5mg/ml的纳米SiO2组增加，25mg/ml纳米SiO2组大鼠肺组织脏器系数高于对照组但低于同浓度微米SiO2组；25mg/ml微米SiO2染尘组大鼠出现肺组织正常结构破坏，炎性细胞轻度浸润，细胞性结节形成、胶原纤维增多的病理改变，25mg/ml纳米SiO2染尘组大鼠未形成明显结节，病理改变较微米SiO2组轻微；25mg/ml微米和纳米SiO2染尘大鼠肺组织超微结构表现出Ⅱ型肺泡上皮细胞增殖，排出嗜锇板层小体，肺泡巨噬细胞大量增生、吞噬尘粒、脂质和嗜锇小体的改变；透射电镜和能谱仪结合检测发现灌肺后24h内微米SiO2染尘组大鼠尿液中有少量粒子排出，而纳米SiO2染尘组大鼠尿液中有大量粒子排出；6.25、12.5、25mg/ml纳米SiO2及25mg/ml微米SiO2染尘组大鼠肺组织MDA生成量及MMP-2表达量增加，12.5、25mg/ml纳米SiO2及25mg/ml微米SiO2染尘组大鼠肺组织NO、羟脯氨酸生成量增加，25mg/ml微米SiO2组NO、羟脯氨酸的生成量及TNF-α、IL-1β及MMP-2的表达量高于同浓度纳米SiO2组；流式细胞仪测定12.5、25mg/ml纳米SiO2及25mg/ml微米SiO2组肺细胞凋亡率增加，25mg/ml微米SiO2组肺细胞凋亡率高于同浓度纳米SiO2组，6.25、12.5、25mg/ml纳米SiO2及25mg/ml微米SiO2致G1期细胞增多，S期、G2/M期及细胞增殖指数降低，25mg/ml微米SiO2组G1期、S期细胞及细胞增殖指数高于同浓度纳米SiO2组。提示纳米SiO2经呼吸道进入肺部后，与微米SiO2一样，在AMs脂质过氧化反应的介导和释放TNF-α、TGF-β1、IL-1β等细胞因子的调节下，导致肺部炎症、肺泡损伤及胶原代谢紊乱，细胞外基质沉积，从而导致肺纤维化。　　 以上结果提示在体外细胞毒性实验中，纳米SiO2粒子与微米SiO2一样可通过诱导脂质过氧化作用引起细胞形态和超微结构改变、细胞膜流动性下降及通透性升高、细胞内游离Ca2+水平增高，细胞凋亡率增高，细胞周期异常，从而使体外培养RAW264.7细胞的生长受到抑制、结构和功能受到损伤；纳米SiO2刺激RAW264.7细胞的培养上清可致细胞因子TGF-β1、IL-1β和基质金属蛋白酶MMP-2释放量增加，由此促进CHL细胞增生，胶原合成增多，具有潜在的致纤维化作用。其细胞毒性纳米SiO2高于微米SiO2。整体动物实验结果提示，纳米SiO2也可通过诱导经呼吸道染尘大鼠肺组织脂质过氧化作用增强，介导细胞因子TNF-α、TGF-β1、IL-1β和基质金属蛋白酶MMP-2表达增加以及肺细胞凋亡率增加、细胞周期改变，引发肺组织损伤，导致肺脏器系数增加、肉芽肿结节形成、肺组织内羟脯氨酸含量增高，发生纤维化，但由于纳米SiO2粒子粒径小，易于扩散进入肺间质，并经毛细血管进入血循环，使肺泡中储留的纳米SiO2粒子的量逐渐减少，导致纳米SiO2对肺的损伤作用弱于微米SiO2。但必需关注纳米SiO2浓度较高时其急性肺损伤作用较微米SiO2强，而且多次灌注、长期染尘后纳米SiO2的肺损伤作用也有待我们进一步研究。本研究结果为深入认识和评价纳米SiO2的安全性提供了基础毒理学资料，也为今后采取有效措施避免重蹈微米SiO2严重危害劳动者健康的覆辙提供了科学依据。