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Graves病(GD)是一种常见的公认的器官特异性自身免疫病。目前认为促甲状腺激素受体(TSHR)是GD的主要抗原，TSHR抗体(TRAb)是GD的重要效应因子，并且是GD发病中较靠下游的环节。因此寻找GD发病的启动因子成为GD免疫致病机制研究的热点问题。共刺激分子及其介导的共刺激信号在特异性免疫应答过程中起着重要的调节作用，尤其在T细胞的活化、增殖、失能、凋亡等方面起着极为关键的决择作用。在自身免疫性疾病中，共刺激分子的表达异常引起自身反应性T细胞的过度活化，逃脱外周耐受而致病。本课题以Graves病作为研究对象，探讨一系列共刺激分子在GD患者甲状腺组织和原代培养的甲状腺滤泡细胞上的表达及其生物学意义，并在体外研究共刺激信号对原代培养的甲状腺滤泡细胞生物学行为的影响，进一步阐明GD免疫致病机制的始动环节，为在此基础上采用免疫干预治疗以达到根治GD提供理论基础和实验依据；针对GD患者外周血中存在的自身反应性CD4~+CD28~-T细胞，采用细胞生物学、分子生物学等手段研究其生物学特性及其临床意义，探讨其作为GD严重性、活动性及预后判断的免疫学指标的可行性，并为GD的免疫治疗开辟新思路。 一、共刺激分子在Graves病甲状腺组织中的表达 本研究运用了细胞培养、流式细胞术和RT-PCR技术，检测在10例GD组织中共刺激分子基因的表达水平，原代培养的甲状腺滤泡细胞共刺激分子的表达及细胞因子对其表面共刺激分子表达的调节作用。结果发现，GD组织一系列共刺激分子基因mRNA的表达明显高于对照组，其中共刺激分子CD40L和ICOS基因mRNA在9例GD患者组织中检出，与对照组相比具有统计学差异(P＜0.05和P＜0.01)；共刺激分子CD40基因mRNA在7例GD患者组织中的表达明显高于对照组(P＜0.05)。体外原代培养的GD组(5例)和非毒性甲状腺肿(Nontoxic goiter，NTG)组(6例)共刺激分子在Graves病中的表达及其生物学意义中文摘要甲状腺细胞均有CD40分子的表达，但GD组甲状腺细胞的CD40分子表达(44.62士9.76%)略高于NTG组(39.47士24.27%)，但无统计学意义差别(P>O.05);炎症类细胞因子IFN一Y、IL一6和TNF一。可上调原代培养的甲状腺滤泡细胞表达共刺激分子CD40(均P<0.01)和GL50(均P<0.05)。 由此表明，在GD异常的免疫应答过程中，甲状腺滤泡细胞把自身抗原递呈给T细胞，共刺激信号进一步介导两者间的相互作用，促进ThZ细胞极化，辅助B细胞活化并产生大量的自身抗体TRAb，诱发、维持和加重甲状腺的自身免疫，尤其是CD40一CD40L和ICOS/GL50信号在GD免疫病理中有至关重要的作用。随着共刺激信号参与该病免疫致病机制的深入揭示，将会为临床治疗GD提供新的免疫治疗靶分子。二、共刺激信号转导对甲状腺原代培养上皮细胞生物学行为的影响 采用甲状腺组织细胞体外培养方法，探讨共刺激信号CD40一CD40L和ICOS一GL50对甲状腺原代培养细胞生物学特性的影响。本研究初步发现，原代培养的甲状腺滤泡细胞经不同浓度的激发性CD40单抗(5 Cll)刺激培养后，呈现剂量依赖性地促进其增殖作用的倾向;且明显促进甲状腺滤泡细胞合成甲状腺素FT3和FT4(P值分别为0.015和0.033)，以及分泌甲状腺球蛋白(P值为0.016)。激发性CD4O单抗(SCll)联合hTSH能显著促进人原代培养甲状腺滤泡细胞的增殖和甲状腺球蛋白的分泌(P值均<0 .01)，对甲状腺滤泡细胞合成甲状腺素FT3和FT4亦有一定的促进作用。工FN一Y对人原代培养甲状腺滤泡细胞的增殖有明显抑制作用(尸值<005);而激发性CD40单抗(SCll)有部分逆转IFN一Y对甲状腺滤泡细胞增殖抑制作用的趋向性。提示CD40一CD40L共刺激信号能直接促进原代培养的甲状腺滤泡细胞的生长和分化，导致滤泡细胞的增生和肥厚，分泌大量的甲状腺素，引起高甲状腺素毒血症。ICOS转基因L929细胞对原代培养甲状腺滤泡细胞的生物学行为亦产生明显的影响，与对照空载体转基因细胞相比，能明显促进甲状腺滤泡细胞的体外生长，促进合成甲状腺素FT3和FT4以及分泌甲状腺球蛋白，尸值均<0.01。由此表明转基因细胞表达的ICOS分子与甲状腺滤泡细胞表达的GL50分子相互作用产生的共刺激信号，具有促进滤泡细胞的生长和功能介导的作用。共刺激分子在Graves病中的表达及其生物学意义中文摘要 在GD的自身免疫反应中，ICOS一GL50和CD4O一CD40L信号交叉调节参与了原代培养的甲状腺滤泡细胞的生长、免疫及代谢过程，引起滤泡细胞合成和分泌甲状腺素及甲状腺球蛋白失控性增多，引发高甲状腺素毒血症。提示在免疫干预过程中，要充分考虑到共刺激途径的多样化和复杂性，选择更为关键的靶分子或联合多种调节因子阻断自身免疫反应的多个环节。三、GraveS病患者外周血CD矿CD28一T细胞的生物学特性及其临床意义 本研究采用荧光标记、胞内细胞因子染色和流式细胞术分析GD患者外周血CD4十CD28一T细胞的表型特征;流式分选和实时定量PCR(Real一time PCR)技术分析GD患者外周血CD4+CD28一T和CD4十CD28十T细胞亚群T细胞受体(TCR)可变区的基因表达变异性。并且通过分析GD患者外周血CD4+CD28“T细胞亚群的数量和功能的变化及其与Graves病的临床相关的?