近年伴随着经济的快速发展,以及西方国家生活方式的影响,我国居民的生活饮食结构发生了巨大变化,快餐、油脂等高脂高热量饮食摄入量较前明显增加。高脂高热量饮食的危害也逐渐显现。高脂高热量饮食摄入量增加,与2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）、高尿酸血症、非酒精性脂肪肝、代谢综合征（Metabolic syndrome,MS）等发病有关。胰岛素抵抗（Insulin resistance,IR）是这些代谢性疾病,尤其是2型糖尿病发生发展的重要病理基础之一。调查显示,中国2型糖尿病的发病率呈逐年上升趋势,对人类健康和生活质量产生重大威胁,已经成为危害全球的公共健康问题。2型糖尿病的发生发展与多种因素有关,尤其与高脂高热量饮食和缺乏运动的生活方式有关,肥胖和胰岛素抵抗是2型糖尿病的核心,但是具体的发病机制并不十分明确。高脂饮食导致的胰岛素抵抗以及异位脂质沉积是重要的病理变化,也是研究2型糖尿病的发病机制和治疗途径的较好的模型。我们课题组在前期的基础研究中已经成功建立了高脂饮食喂养诱导出的胰岛素抵抗以及异位脂质沉积的小鼠的动物模型,并对脂肪因子、炎症因子、氧化应激、细胞凋亡与胰岛素抵抗的关系进行过一些研究,特别是脂肪因子脂联素与胰岛素抵抗关系的研究。脂肪组织是人体最大的内分泌器官,它分泌大量的生物活性分子,脂联素（Adiponectin,APN）是其分泌最丰富的脂肪因子之一,能够发挥改善组织的胰岛素敏感性、调节糖脂代谢、抗动脉粥样硬化和心脏保护等多种有益作用。尽管在脂联素与糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化方面的研究不少,但在脂联素干预方面研究还不多。本研究首先对代谢综合征人群和2型糖尿病人群进行分析,了解血浆脂联素以及脂联素基因多态性与代谢综合征、2型糖尿病及其大血管并发症发生的关系。并通过高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠模型,了解脂联素干预对高脂饮食诱导的小鼠胰岛素抵抗和肝脏、骨骼肌脂质沉积的影响,进一步探讨脂联素在改善胰岛素抵抗、糖脂代谢紊乱等方面的作用机制,为寻找代谢性疾病新的治疗靶点,提供理论依据。本研究分为四个部分:第一部分血浆脂联素水平及基因多态性与代谢综合征的相关研究。第二部分血脂联素水平与2型糖尿病的相关研究。第三部分脂联素干预对高脂诱导胰岛素抵抗小鼠异位脂质沉积及炎症因子的影响。第四部分脂联素干预对胰岛素抵抗小鼠胰岛素信号通路的影响。第一部分血浆脂联素水平及基因多态性与代谢综合征的相关研究目的:比较代谢综合征人群血浆APN水平及基因多态性的变化,进一步探讨APN与代谢综合征的关系。方法:选取2014年4月至2016年3月河北省汉族志愿者,年龄25-65岁之间。符合受试者标准256例,按照是否存在MS分为两组:MS组（n=142）符合以下三项或全部四项:1)腹型肥胖:腰围男性≥90cm,腰围女性≥85cm。2)高血糖:空腹血糖≥6.1mmol/L,或糖负荷后2h血糖≥7.8mmol/L和（或）已确诊为糖尿病并经治疗者。3)高血压:血压≥130/85mm Hg及（或）已确诊为高血压并治疗者。4)空腹甘油三脂（Triglyceride,TG）≥1.7mmol/L。5)空腹高密度脂蛋白胆固醇（High-density lipoprotein,HDL-C）<1.04mmol/L。健康人群（n=114）作为对照组。测定2组中腰围（Waist circumference,WC）、血压、空腹血糖（Fasting blood glucose,FBG）、空腹胰岛素（Fasting insulin,FINS）、总胆固醇（Total cholesterol,TC）、低密度脂蛋白（Low-density lipoprotein,LDL-C）、TG、HDL-C、糖化血红蛋白（Hb A1c）,脂联素（Adiponectin,APN）水平的变化,检测APN rs121917815基因多态性。结果:1.MS组的体重指数,腰围,收缩压,舒张压和空腹胰岛素水平均高于健康对照组（P<0.05）,高密度脂蛋白水平显著低于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。2.MS组的血浆APN水平低于对照组,水平差异具有统计学意义（p<0.05）。3.对照组114例受试者的rs121917815基因型分布为:CC基因型41（35.96.2%）,CT基因型36（32.45%）,TT基因型37（32.45%）;MS组142例受试者的APNrs121917815基因型分布为:CC基因型68（47.89%）,CT基因型42（29.58%）,TT基因型32（22.53%）;与对照组相比,MS组的CC基因型基因频率显著增加,具有统计学差异（p=0.025）。MS组与对照组相比较,相对风险分析结果为:OR=1.64,95%CI=（1.05-2.30）,提示CC基因型可能增加MS的患病风险。对照组APNrs121917815的C、T等位基因频率分别为51.76%和48.24%;MS组C、T等位基因频率分别为62.68%和37.32%。卡方检验结果提示,两组等位基因频率分布存在差异,APNrs121917815的C等位基因的频率MS组显著高于对照组,具有统计学差异（p=0.019）。对照组与MS组相比较,相对风险分析结果为:OR=1.71,95%CI=（1.03-2.98）,提示C等位基因携带者患MS的风险可能增加。小结:1.血浆APN水平与代谢综合症密切相关,血浆APN水平在代谢综合症患者中明显下降。2.APN基因多态性位点rs121917815与MS相关,CC基因型和C等位基因携带者可能增加MS的患病风险。第二部分血脂联素与2型糖尿病的相关研究目的:比较2型糖尿病人群血浆APN水平的变化,进一步探讨APN与2型糖尿病及动脉粥样硬化的关系。方法:选取2015年3月至2016年3月住院患者,年龄在25-65岁。其中单纯2型糖尿病组（T2DM组）34例,合并大血管病变（Macrovascular disease,MVD）组34例,糖尿病诊断标准按照1999年WHO糖尿病诊断标准,糖尿病合并MVD组包括有心脑血管病变和下肢动脉病变（急性期除外）。同期从体检中心选取性别年龄相匹配的健康对照组。受试者知情同意后,空腹测量身高、体重、腰围、收缩压（SBP）和舒张压（DBP）。留取空腹静脉血标本,测定血糖、甘油三脂、胆固醇、低密度脂蛋白、空腹胰岛素、糖化血红蛋白及血浆脂联素水平。结果:1.三组年龄、性别无统计学差异（P>0.05）,T2DM组和MVD组与对照组比较,BMI、FBG、TC、TG、FINS均升高,有统计学差异（P<0.05）。2.MVD组、T2MD组的血浆APN水平均低于对照组,MVD组低于T2MD组,差异均有统计学意义（P<0.05）。MVD组、T2MD组的PAI-1的水平高于对照组,MVD组高于T2MD组,差异均有统计学意义（P<0.05）。3.Pearson相关性分析表明,如表2所示,T2DM组的血浆APN水平与体重指数,空腹血糖,空腹胰岛素和甘油三酯水平呈负相关（P<0.05）,而与ISI正相关（P<0.05）。MVD组APN水平与BMI和SBP以及FBG,FINS和TG水平呈负相关（P<0.05）。T2DM组、MVD组中,APN的血浆水平均与PAI-1的血浆水平呈负相关（P<0.05）。4.血浆APN水平和其它参数的多元逐步回归分析表明,血浆脂联素水平作为因变量,而其他参数被指定为自变量。在MVD组的回归方程中,自变量有BMI和SBP以及TG、PAI-1。T2DM组,BMI,TG和PAI-1与血浆APN水平独立相关。MVD组BMI,FCP,PAI-1和FBG与血浆APN水平独立相关。小结:1.血浆脂联素水平、PAI-1水平与2型糖尿病密切相关,2型糖尿病患者血浆脂联素水平降低,而PAI-1增高。2.血浆脂联素水平、PAI-1与2型糖尿病大血管病变并发症、动脉粥样硬化密切相关,血浆脂联素水平在2型糖尿病大血管病变患者中进一步下降,而PAI-1进一步升高。第三部分脂联素干预对高脂诱导胰岛素抵抗小鼠异位脂质沉积及炎症因子的影响目的:探讨脂联素对高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠血糖、胰岛素、胰岛素敏感性指数、血脂、炎症因子以及肝脏、骨骼肌脂质沉积的影响。方法:C57BL/6J小鼠随机分为对照组（CON）10只和高脂组（HFD）20只。正常对照组给予普通饲料,高脂饮食组给予高脂饲料。饲养小鼠期间,记录每周体重及摄食量。8周后行腹腔注射糖耐量实验（IPGTT）,评估胰岛素抵抗模型是否建立,将HFD组小鼠随机抽取10只作为脂联素干预组（HFD+APN）,脂联素干预组给予腹腔注射外源性重组脂联素,每天15μg/kg,共6周。CON和HFD组给予相应剂量的0.9%氯化钠溶液腹腔注射,共6周。干预6周后,再次行IPGTT试验,检测0 min、15 min、30 min、60 min、120 min血糖值并计算葡萄糖曲线下面积（AUC）。采集血清测空腹血糖（FBG）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）,用酶联免疫吸附实验法（ELLSA）测空腹胰岛素（FINS）水平、脂联素（adiponectin,APN）、白介素6（interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor,TNF-α）,并计算胰岛素敏感性指数（Quantitative insulin sensitivity check index,QUICKI）。留取肝脏组织标本进行H&E染色和骨骼肌组织进行油红染色,观察肝脏、骨骼肌组织病理形态变化及脂质含量。结果:1高脂饮食诱导小鼠胰岛素抵抗模型的建立。高脂饮食干预第8周后,HFD组较CON组小鼠体重明显增加（P<0.05）。HFD组小鼠平均每日摄食量较CON组明显增加（P<0.05）。8周末行IPGTT试验,HFD组较CON组小鼠在0 min、15min、30 min、60 min、120 min血糖水平显著升高（P<0.05）,与CON组相比,HFD组葡萄糖曲线下面积显著增加（P<0.05）,提示成功建立高脂诱导胰岛素抵抗模型。2脂联素干预6周各组小鼠体重摄食量及胰岛素抵抗参数的变化。HFD组小鼠体重较CON组显著增加（P<0.05）,HFD+APN组小鼠体重在脂联素干预4周后有下降趋势,但较HFD组无明显统计学意义,HFD组小鼠每日摄食量较CON组显著增加（P<0.05）,HFD+APN组小鼠每日摄食量较HFD组无差异。于6周末行IPGTT实验,HFD组较CON组小鼠血糖水平均明显升高（P<0.05）,HFD+APN组较HFD组相比小鼠血糖水平均下降（P<0.05）。与CON组相比,HFD组的AUC曲线下面积显著增加（P<0.05）,与HFD组相比,HFD+APN组的AUC曲线下面积显著下降（P<0.05）。与CON组相比,HFD组的小鼠空腹血糖、胰岛素水平明显升高（P<0.05）,而HFD+APN组空腹血糖和胰岛素水平较HFD组明显降低（P<0.05）。HFD组QUICKI值较APN组明显降低（P<0.05）,脂联素干预后,QUICKI值显著升高（P<0.05）。3各组小鼠血脂水平比较。HFD组TG、TC、LDL-C、HDL-C水平显著高于CON组（P<0.05）,HFD+APN组TG、TC、LDL-C水平明显低于HFD组（P<0.05）,HDL-C水平未有明显变化。4脂联素对各组小鼠模型炎症标志物的影响。HFD组小鼠血清和肝脏组织TNF-α、IL-6水平明显高于CON组（P<0.05）,HFD+APN组小鼠血清和肝脏组织TNF-α、IL-6明显低于HFD组（P<0.05）。HFD组小鼠血清和肝脏组织APN水平明显低于CON组（P<0.05）,HFD+APN组小鼠血清和肝脏组织APN明显高于HFD组（P<0.05）。5各组小鼠肝脏,骨骼肌组织形态学比较5.1肝脏H&E染色CON组可见肝组织结构清晰完整,肝细胞胞浆均匀红染,脂滴空泡较少,未见明显脂肪变性;HFD组肝组织结构紊乱模糊,肝细胞胞浆内可见大小不等的脂滴空泡,脂滴将细胞核挤于细胞边缘,呈明显的脂肪变性;与HFD组相比,HFD+APN组肝组织细胞脂肪变性明显减轻,脂滴空泡明显减少。5.2骨骼肌油红染色CON组小鼠骨骼肌细胞质内无脂滴,HFD组小鼠骨骼肌细胞内可见脂滴较多,核位于肌膜下方,糖原颗粒蓄积,HFD+APN组脂滴较HFD组减少。小结:1.高脂饮食可以诱导小鼠体重增加伴随脂质异常,骨骼肌、肝脏脂质沉积,炎症反应形成胰岛素抵抗。2.脂联素干预可改变高脂饮食小鼠肝脏、骨骼肌脂质沉积,降低炎症反应,进而改善胰岛素抵抗和血脂紊乱。第四部分脂联素干预对胰岛素抵抗小鼠胰岛素信号通路的影响目的:研究APN对胰岛素抵抗小鼠IRS/PI3K/Akt信号通路的影响,探究脂联素在改善高脂诱导小鼠胰岛素抵抗的作用机制。方法:采用第三部分方法对动物进行分组及标本采集。采用western blot技术检测肝脏、骨骼肌、肾周脂肪组织,胰岛素信号通路IRS1/2、p-IRSTyr1/2、PI3K、p-PI3K,Akt及p-Akt的表达,以及脂联素信号通路Adipo R1、AMPK及其磷酸化的蛋白水平。结果:1.脂联素干预后胰岛素信号通路相关指标的表达三组间,高脂饮食的小鼠与CON组相比小鼠肝脏,骨骼肌,脂肪组织IRS1/2、p-IRSTyr1/2、PI3K、p-PI3K,Akt及p-Akt水平降低（P<0.05）,脂联素干预6周后HFD+APN组,IRS1/2、p-IRSTyr1/2、PI3K、p-PI3K,Akt及p-Akt水平较HFD组显著增加（P<0.05）。2.脂联素干预后Adipo R1/AMPK蛋白的表达三组间,高脂饮食的小鼠与CON组相比小鼠肝脏,骨骼肌,脂肪组织Adipo R1、p-AMPK水平显著降低（P<0.05）,脂联素干预6周HFD+APN组,Adipo R1、p-AMPK水平较HFD组显著增加（P<0.05）。小结:1.脂联素通过上调高脂饮食小鼠肝脏、骨骼肌、肾周脂肪组织IRS1/2、PI3K、Akt表达水平,调控IRS-1/PI3K/Akt通路,从而改善胰岛素抵抗及糖代谢紊乱。2.脂联素能够上调脂联素受体及p-AMPK,加强脂肪酸的氧化过程,从而改善肝脏、骨骼肌、肾周脂肪组织的脂质沉积。结论:1.血浆脂联素水平减低与代谢综合征、2型糖尿病及糖尿病大血管并发症的发生密切相关;脂联素基因多态性与代谢综合征有关。2.脂联素干预可改变高脂饮食小鼠肝脏、骨骼肌脂质沉积,降低炎症反应,进而改善胰岛素抵抗和血脂紊乱。3.脂联素对高脂饮食小鼠肝脏、骨骼肌、肾周脂肪组织胰岛素抵抗干预的机制是上调了这些组织胰岛素信号通路IRS1/2、PI3K、Akt的表达水平,并且同时上调了Adipo R1/AMPK通路,加强了脂肪酸的氧化过程。