枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）具有分泌包括Bacillopeptidase F（Bpr）在内的许多胞外蛋白酶的能力,而Bpr因其具有纤溶活性在制药行业中备受关注。在以往的研究中,已发现了分子量为33 kDa-90 kDa的多种Bpr活性形式,但对于出现这种多样性的原因尚不清楚。为了解决这一问题,需要阐明Bpr的加工和成熟的机制。此外,对Bpr成熟机制的阐明将有助于制备有活性Bpr,并促进其在制药行业中的应用。枯草芽胞杆菌LZW菌株（B. subtilis LZW）分离自土壤,并且能分泌胞外蛋白酶。在本项研究中,我们从该菌株基因组中克隆编码蛋白酶Bacillopeptidase F（BprL）的基因bprL,并对该酶的加工和成熟机制开展研究。首先,在含有纤维蛋白的LB琼脂平板上培养菌株LZW,根据其菌落周围形成纤维蛋白水解圈,确认该菌株具有纤溶活性。根据枯草芽孢杆菌168（B. subtilis 168）菌株的Bpr基因序列,采用PCR技术从LZW菌株基因组中扩增获得基因bprL,并进行了测序。结果表明,bprL的ORF编码1433个氨基酸残基的BprL前体,其中包括信号肽（30个氨基酸残基）、N-末端前肽（164个氨基酸残基）、催化结构域（327个氨基酸残基）和C端序列（912个氨基酸残基）。BprL前体与来自168菌株（B. subtilis 168）和纳豆枯草芽孢杆菌（B. subtilis natto）的Bpr前体的氨基酸序列同一性分别达到98%和97%,它们的非保守的氨基酸残基主要位于C端序列。此外,bprL的ORF上游有一个DegU依赖性启动子,而下游有一个预测的转录终止位点。利用枯草芽孢杆菌WB700（B. subtilis WB700）菌株作为宿主表达bprL,研究了重组BprL的体内（in vivo）加工与成熟机制。通过缺失分析,发现bprL的上游序列（包含DegU依赖性启动子和RBS）在该基因的表达方面发挥了重要作用。通过对重组菌株培养物上清液的SDS-PAGE分析,发现BprL在WB700菌株中表达后产生了四个表观分子量分别为85、75、45和33 kDa的主要加工产物。蛋白质印迹分析显示,分子量为85 kDa和75 kDa这两个蛋白含有催化域和部分C端序列；45 kDa蛋白仅含有催化结构域；33 kDa蛋白则是C端序列的降解产物。酶活性测定结果表明,45 kDa蛋白具有蛋白酶活性和纤维蛋白溶解活性,85 kDa和/或75 kDa蛋白也有蛋白酶活性。我们构建了BprL的活性位点突变体BprL-S258A并将其在WB700菌株中表达,发现BprL-S258A可加工为85 kDa蛋白,但未形成75、45和33 kDa蛋白。这些结果表明,75、45和33 kDa蛋白是BprL前体的自加工产物,而85 kDa蛋白是外源加工产物。此外,我们还构建了C端序列缺失变体BprLA912,该突变体在WB700菌株中可加工成45 kDa蛋白,表明45 kDa蛋白是BprL最小成熟形式。因此,BprL的in vivo成熟过程中既有自加工步骤,也有外源加工步骤,从而产生多种成熟酶形式。我们进一步在大肠杆菌中表达了BprL及其C端序列系列截短的突变体,并且进行了体外（in vitro）复性和加工分析。结果显示,全长BprL酶原无法加工成有活性的成熟形式,而C端序列截短突变体BprLΔ678和BprLΔ912可以加工成45 kDa成熟酶形式。这一结果表明,BprL的C端序列有助于保持酶的非活性状态,可防止该酶在不适宜的时间和空间过早成熟而对细胞造成损害。这些结果还说明,BprL自加工成熟途径的起始需要先通过外源加工切除部分C端序列后才能起始。另外,我们还发现BprL的N端前肽的切除是分步进行的。首先,在该酶原自身活性位点的介导下,N端前肽的核心结构域（N*）被顺式加工（分子内加工）切除；然后,残余的N端前肽片段（连接肽）被反式加工（分子间加工）切除。而且,将BprL的N端前肽顺式加工位点Lys（-16）-Ser（-15）附近的Phe（-17）替换为Tyr后,该酶成熟速度加快。