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目前临床中牙周炎常见的治疗方法包括牙周翻瓣术、引导组织再生、材料移植和使用重组生长因子等,这些方法能够在一定程度上控制炎症和修复部分牙周组织,但是无法再生完整的功能性牙周组织。2004年在人牙周组织中首次分离出具有多向分化潜能的牙周膜干细胞(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs),大量研究结果表明其能够有效修复牙周缺损。然而PDLSCs的体外获取具有侵入损伤性,而且扩增程序繁琐。因此如何促进PDLSCs的增殖及分化是牙周组织工程新的挑战。2008年首次从人尿液中分离出尿源干细胞(Urine-derived stem cells,USCs),表现出自我更新、稳定扩增和多向分化潜能等特性。目前USCs已被应用于再生医学的多个方面,包括膀胱及尿道重建,神经系统修复和伤口愈合等。USCs无血清培养基中包含了多种生长、炎症和免疫调节因子,通过旁分泌效应能够增强体外重复传代的骨髓间充质干细胞的成软骨分化能力以及有效减轻严重的后肢缺血损伤。本实验拟通过间接共培养技术研究USCs对PDLSCs增殖及分化的影响。体外实验材料方法:体外分离并通过流式细胞仪检测细胞表面标记物和多向分化能力鉴定原代PDLSCs和USCs,采用0.4μm孔径大小的Transwell构建间接共培养体系,按照PDLSCs/USCs为1/0.5、1/1和1/2的比例进行间接共培养,在接种后的第1、3、5及7天使用CCK8检测USCs对PDLSCs增殖的影响;成骨诱导7天后对PDLSCs进行碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)染色及活性检测,并通过RT-PCR和Western blot检测ALP、RUNX2、OCN、POSTN和CEMP1在PDLSCs中的表达;成骨诱导21天后进行茜素红染色及半定量分析;ELISA检测USCs无血清培养基以及间接共培养体系中VEGF和b-FGF的含量;成骨诱导10天后获取PDLSC膜片进行电镜扫描观察表面结构,并进行H&E及免疫组化染色。结果:1、PDLSCs和USCs通过茜素红染色和油红O染色发现均能够形成矿化结节和脂质滴。此外,流式细胞术分析显示PDLSCs和USCs对间充质干细胞表面标记物CD90和CD105及周细胞表面标志CD146均呈阳性。两种细胞对造血细胞相关表面标志物CD31、CD34和CD45都呈阴性结果。2、CCK8检测发现USCs通过间接共培养能够促进PDLSCs的增殖。3、RT-PCR和Western blot检测发现USCs能显著促进PDLSCs表达ALP、RUNX2、OCN、POSTN和CEMP1。4、ELISA检测发现USCs无血清培养基含有VEGF和b-FGF,间接共培养体系中USCs能够提高培养基中VEGF和b-FGF的表达。5、电镜扫描与H&E染色结果显示,USCs能够促进PDLSC膜片形成更多的细胞层次和细胞外基质以及更加致密的网状结构。免疫组化染色显示,USCs促进PDLSC膜片对OCN、POSTN和CEMP1等靶蛋白的阳性表达。结论:USCs能促进PDLSCs的增殖及成骨/成牙骨质向分化,并且能够促进PDLSC成骨膜片的形成和成骨/成牙骨质向分化。体内实验材料方法:选用10只6周龄的裸小鼠,分为实验组与对照组(每组5只)。实验组:PDLSCs/USCs为1/2的比率进行间接共培养构建的PDLSC膜片包裹30 mg纳米羟基磷灰石(nano-.hydroxyapatite,nano-HA)形成球形移植物植入裸鼠皮下;对照组:无USCs间接共培养的PDLSC膜片包裹30 mg nano-HA形成球形移植物植入裸鼠皮下。移植6周后,处死裸鼠并取出移植物进行组织学观察。结果:1、H&E和Masson三色染色显示实验组的PDLSC膜片在nano-HA材料表面形成了大量密集而显著的胶原纤维结构。2、免疫组化染色显示,实验组POSTN和CEMP1的阳性表达明显高于对照组。结论:USCs能促进PDLSC膜片在体内的多向分化,具有应用于牙周组织工程的潜力。