皮肤是人体防御外界的有效屏障,在抵御细菌侵入,异物入侵以及防止脱水等方面起着重要作用,因此其完整性对于人体来说至关重要。众所周知,伤口愈合是一个复杂的生理过程,而糖尿病,血管疾病,高龄等因素会影响伤口愈合,最终形成慢性伤口。传统观念认为生长因子是促进伤口愈合的主要驱动力,但最终FDA只批准了人重组血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)(becaplermin凝胶)来治疗糖尿病足溃疡,但其疗效不佳,成本高昂,具有致癌风险等弊端逐渐显露。现今全球患有慢性伤口的人口在不断增加,所以我们急需开发出新型效果良好且价格低廉的促进伤口愈合的药物。热休克蛋白90(90 kDa heat shock protein,Hsp90)是一种普遍存在于几乎所有细胞中的分子伴侣,它在进化上高度保守,主要作用是维持细胞内蛋白质稳定。最近众多研究表明当组织受到创伤时,细胞会通过分泌Hsp90α到胞外来影响细胞的迁移,促进伤口愈合。低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP-1),也称为CD91,是I型跨膜蛋白,主要介导胞吞以及信号通路的传导,近年来越来越多研究证明胞外Hsp90α(eHsp90α)通过LRP-1来传递细胞迁移信号。海肾荧光素酶双分子互补(split renilla luciferase protein fragment-assisted complementation,SRL-PFAC)技术是一种用于研究蛋白质间相互作用的新方法。在实验室前期工作中,我们构建了基于Hsp90与Cdc37的SRL-PFAC方法,并用来监测Hsp90/Cdc37之间的相互作用,结果证明SRL-PFAC技术具有特异性且能够敏感地定量反映结合水平差异,所以可以用来筛选Hsp90/Cdc37抑制剂。基于此,我们计划构建基于Hsp90和LRP-1的SRL-PFAC方法,验证其特异性并运用该方法筛选具有促细胞迁移作用的多肽。我们首先构建了pcDNA3.1(+)-S1-LRP-1 II与pcDNA3.1(+)-S1-LRP-1两种质粒,Luciferase结果表明NRL-Hsp90与S1-LRP-1 II以及NRL-Hsp90与S1-LRP-1无论是在细胞膜上还是在细胞内均有显著的互补作用。Western blot结果表明转染的Hsp90与LRP-1在膜上以及胞内表达,但未分泌到DMEM中。因为LRP-1为跨膜蛋白且NRL-Hsp90与S1-LRP-1 II在细胞膜上有更好的互补性,所以我们选择pcDNA3.1(+)-S1-LRP-1 II进行下一步的实验。Luciferase结果表明实验室前期已经验证的具有促进细胞迁移作用的多肽KR-9(KPHAEVVLR),LR-6(LYAEER),IL-6(INFEKL),LN-6(LRDILN)其细胞膜上以及细胞胞内的荧光值均大于control,而没有促进细胞迁移作用的多肽VK-7(VNAIVFK)其在细胞膜上和细胞内的荧光值均低于control,表明我们构建的SRL-PFAC方法能够准确反映出多肽是否具有促迁移作用,所以能够用来筛选多肽。接下来我们用SRL-PFAC方法筛选了两条多肽RE-7(RYPILPE),ES-9(EAGREVVGS)。Transwell结果显示这两条多肽确实能够促进有效促进HSF细胞的迁移,MTS结果表明这两条多肽均不能促进HSF细胞的增殖,但对HSF细胞并没有毒害作用。