研究背景艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染引起的,严重威胁人类健康的传染性疾病。据UNAIDS统计,2008年全球感染HIV的人数有3340多万,而08年新增的HIV感染者数量为270万,因艾滋病死亡的人数高达200万。我国自1985年首次发现HIV感染者,截止2009年10月底,估计有74万人发生了感染,且2009年新增的感染者数量为4.8万。在非洲的有些国家,HIV的感染率达总人口30%以上。因此,预防和治疗艾滋病,已不仅仅是挽救个人生命的问题,而是关系到民族存亡的大事。由于有效的艾滋病疫苗在短时期内还难以面世,开发高效、安全和廉价的抗HIV药物依然是挽救艾滋病人生命的关键举措,也是艾滋病防治的当务之急。目前应用于临床的抗HIV药物中逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂有26种、进入抑制剂和整合酶抑制剂才3种,但前两类药物容易引起病毒耐药现象和严重的毒副作用。因此,为了治疗感染了耐药病毒的艾滋病患者,组成更多有效的“鸡尾酒”治疗方案,必须大力开发后两类新作用机制的抗艾滋病药物。其中HIV进入抑制剂,由于能在病毒感染的早期进行阻断,更为有效地预防和治疗HIV感染,而倍受重视。已被批准的HIV进入抑制剂有两种,分别是靶向HIV跨膜蛋白gp41的多肽药物T-20(也叫融合抑制剂)和靶向HIV辅助受体CCR5的受体拮抗剂Maraviroc。Maraviroc只能作用于利用CCR5作为辅助受体的R5病毒,对以CXCR4为辅助受体的X4病毒无效,而T-20则对两类病毒均具有抑制作用。然而,T-20是多肽药物,不能口服,容易被体内的蛋白酶降解,而且价格昂贵不是广大的发展中国家HIV感染者所能承受的,因此开发出具有类似作用机制的非肽类HIV进入抑制剂迫在眉睫。本课题根据实验室在相关领域积累的经验,与相关的研究组合作对大量的有机合成小分子和天然产物提取成分进行抑制HIV进入的体外活性筛选,并进一步的开发完善新的实验方法,研究公认的HIV-1抑制剂ADS-J1对gp41产生抑制作用的具体位点。第一章天然来源化合物抗HIV的活性筛选目的：通过对茶黄素衍生物单体进行结构改造,改变原样品颜色深,水溶性差等缺点,考察改造后的化合物体外抑制HIV-1包膜介导的细胞融合活性和相关的生物学活性,确定改造后成分的可利用度及进一步改造的方向,为该类化合物作为HIV进入抑制剂的作用机制研究提供依据。对番石榴叶提取成分进行体外的免疫,分生活性检测,筛选出能在HIV-1进入阶段发挥作用的成分,并初步探讨其作用机理,填补该类成分在HIV-1进入抑制研究方面的空白。方法：1.茶黄素类衍生物的结构改造和番石榴叶成分提取。茶黄素衍生物是文献中研究最多的从红茶中提取的TF1 (theaflavin), TF2A (theaflavin-3-monogallate), TF3 (theaflavin-3,3’-digallate),分别对它们的苯并酚酮七元环中的1”,2”,3”,7”4个双键进行还原得到对应的化合物TF1-4H,TF2A-4H, TF3-4H。具体操作是在Pt/C的催化下,通入H2还原,然后过滤除掉催化剂,对还原产物用反相柱层析分离纯化得到相应的化合物。参照相关文献,番石榴叶经两次乙醇提取的浸膏用SA-1型大孔树脂吸附,然后用80%(V/V)的乙醇溶液洗脱,得到总皂苷的粗品。番石榴叶的乙醇提取物用FL-1型大孔树脂吸附,然后用0.2%NaOH溶液洗脱,得到总黄酮的粗品。番石榴叶水浸泡液回流提取得到挥发油成分。2.以上样品先用抗体特异性的检测抗原的酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)进行第一次筛选,有效的通过浓度梯度实验考察量效关系,计算抑制率并确定半数抑制浓度(Half of the inhibiting concentration, IC50)范围。进一步的用可直观的从六螺旋束(six-helical bundle,6-HB)条带变化中反映化合物抑制强弱的天然非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native polyacrylamide gel electrophoresis, N-PAGE)确证活性。3.另外用HIV-1包膜介导的细胞-细胞融合实验考察改造后的茶黄素类化合物和番石榴叶的有效成分细胞水平的抑制活性。根据融合时的细胞状态,对样品进行四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)实验检测相应的细胞毒性。结果：1.分离纯化的茶黄素衍生物结构改造后纯化的产物由香港浸会大学提供,本研究主要鉴定结构改造后单体的活性大小。番石榴叶提取成分由南方医科大学中医药学院提供,黄酮粗品中总黄酮量为55.22%,皂苷粗品中总皂苷量为55.3%。2.由于茶黄素化合物本身的不稳定性,多次反复冻融后有部分化合物活性下降或消失,且受样品量的限制,该部分有的实验结果不完善。首先利用抗体特异性的ELISA对茶黄素系列化合物进行第一次筛选,发现25μg/mL的终浓度时,化合物都有很高的抑制率。进一步的梯度稀释时,虽然没有做出TFl的IC50’范围,但在终浓度11.08μM时,抑制率为60%,而还原产物TF1-4H的IC50为0.63±0.27μM,另一组TF2A的IC50=2.60±0.56μM,还原产物TF2A-4H的IC50=1.13±0.27μM,第三组TF3的IC50=0.88±0.34 gM,还原产物TF3-4H的IC50=1.74±0.55 gM。与文献值相比,本研究中IC50值略低,但都在微摩尔水平,且<5μM的范围内。N-PAGE实验的条带显示六个单体随着浓度的降低,6-HB的颜色越来越深,表现出一定的量效依赖关系。用ELISA实验对番石榴叶的三个成分进行初筛时,发现以25μg/mL终浓度初筛,番石榴叶提取物总黄酮和总皂苷对6-HB的抑制率都在80%左右,挥发油成分的抑制活性较低,统计分析显示前两组与相同浓度的阳性对照TF间无差异,而挥发油成分与TF相比差异显著,所以后续实验中去掉该组。在浓度梯度实验中,番石榴叶总黄酮和总皂苷对6-HB的抑制也表现出明显的量效关系,IC50分别为3.9±1.3μg/mL,9.06±0.17μg/mL。进一步的N-PAGE实验结果确证了二者对gp41的作用,结果与ELISA一致，200μg/mL时与相同浓度的阳性药物TF的效果相近,通过对应浓度的条带,清楚的看到样品量与抑制作用之间成正比关系。3.细胞融合结果显示,改造后TF1-4H,TF2A-4H,TF3-4H抑制细胞融合的活性比改造前的TF1,TF2A,TF3稍有增强,都在相应的微摩尔水平。TF1的IC50为14.63±1.40μM,TFl-4H的IC50为11.144±1.02μM。第二组TF2A的IC50为10.30±0.36μM,TF2A-4H的IC50为6.44±0.51μM。第三组TF3的IC50为8.14±0.21μM,TF3-4H的IC50为6.06±0.26μM。由于样品量较少,没有进一步的考察细胞毒性。细胞融合实验中番石榴叶总黄酮和总皂苷都表现出一定的抑制活性,总皂苷的IC50为7.33±0.40μg/mL,总黄酮的IC50为5.3±1.3μg/mL。MTT实验显示总黄酮产生的细胞毒性很小,半数致死浓度(concentration of 50% cytotoxicity, CC50)都在100μg/mL以上,总皂苷对CHO-WT和MT-2的CC50分别为46.86±1.27μg/mL和62.97±1.22μg/mL,统计学结果显示总皂苷在7.82μg/mL以下浓度时CHO-WT的生长与对照组之间没有显著性差异(P＞D.05),在25μg/mL以下MT-2的生长与对照组之间没有显著性差异(P>D.05)。结论：1.茶多酚衍生物是文献报道能对HIV感染的多个环节都有抑制效果的化合物,茶黄素衍生物低浓度时没有表现出抑制CD4,趋化因子受体与gp120的相互作用却表现出抑制gp41核心结构6-HB形成的活性,且观察发现化合物中含有没食子酰基的比不含的活性好,含的个数越多活性越好,推测其活性可能是通过化合物自身带的微弱的负电荷与靶点(如N末端574位的赖氨酸)的正电荷形成离子键实现的。茶多酚自身的多酚结构使它具有上述活性,但是正因为含有多个酚羟基使化合物整体易氧化,不稳定,且与相并的酚酮七元环一起形成一个大共轭体系使得化合物颜色较深,水溶性也不好。我们的研究通过对三个衍生物的酚酮七元环的双键进行还原,在不破坏酚羟基的前提下尽量减少生色基团,并对改造后的产物进行体外活性检测。还原后化合物的颜色变浅,水溶性也增加了。ELISA, N-PAGE实验的结果都显示改造后化合物表现出良好的抑制六螺旋束形成的活性。细胞融合实验显示茶黄素衍生物表现出与文献报道值相似的活性,结构改造后的三个化合物活性比改造前还好,推测可能是因为改造后化合物水溶性提高,稳定性增强,且空间构象也发生了一些变化,相同条件下到达靶位的有效浓度提高,更加有利于化合物与靶点的结合。这些结果既为进一步的结构改造提供了方向又在化合物的作用机制研究方面提供了有力的证据。2.番石榴叶提取物总黄酮和总皂苷虽然是混合成分,但主要成分黄酮和皂苷含量都在55%以上。二者都能在很大范围内安全有效的抑制HIV-1包膜介导的细胞融合,这说明二者可以在HIV的进入阶段起到抑制作用,且细胞毒性实验证明在有效范围内样品对细胞的生长没有抑制作用。而靶向gp41的抗体免疫实验ELISA表明二个样品都可以在微克每毫升的水平抑制gp41核心构象6-HB的形成,该结果还被N-PAGE实验证实,这说明二者在进入过程中的抑制作用可能是通过抑制了该过程中很重要的环节六股螺旋体的结构形成来实现的。第二章ADS-J1抑制HIV进入的作用机制研究目的：通过建立和完善酸性非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Acid native polyacrylamide gel electrophoresis AN-PAGE),研究和探讨ADS-J1与gp41相互作用的机制。方法：建立并完善AN-PAGE,在已有的ELISA, N-PAGE等结果的支持下更清楚直接的反映ADS-J1(4-羟基-5-((E)-(4-(5-羟基-6-((E)-2-甲氧基-5-磺苯基)二氮烯基)-7-磺基萘-2-苯基氨基)-6-苯胺-1,3,5-三嗪-2-苯基氨基)-5-甲氧基-2-甲基苯)二氮烯基)萘-2,7-二磺酸在HIV-1gp41上的作用位点,为其机制研究提供直接可靠的证据。结果：采用AN-PAGE能显示来源于gp41 CHR (C-terminal heptad repeat), NHR (N-terminal heptad repeat)不同区段的多肽条带,同时也能显示6-HB,以及与不同浓度的ADS-J1作用后的6-HB条带。结果表明,ADS-J1能梯度抑制C34与N36形成的6-HB条带,从0到100μM,6-HB的条带颜色逐渐变淡,与单独的C34共同孵育,C34条带没有变化,与单独的包含574位赖氨酸的N36共同孵育后,N36条带消失,与NHR上不包含574位点的其他多肽片段单独孵育,多肽条带都没有变化,与574位位点突变后的多肽片段孵育,对条带也没影响。结论：AN-PAGE的结果表明,从含有20000个化合物的化合物库中筛选出来的偶氮化合物ADS-J1对HIVgp41的作用是通过与gp41核心结构中的NHR同源三聚体螺旋结构表面的疏水深穴的第574位赖氨酸相互作用来实现的,可能是由于ADS-J1自身的磺酸基团与赖氨酸的正电荷之间形成了离子键,从而阻碍了gp41CHR上632位带负电荷的天冬氨酸与赖氨酸的相互作用,破坏了分子内部盐桥的形成,也破坏了六股α螺旋束的稳定性,从而发挥HIV进入抑制的功效。本实验中所用AN-PAGE方法采用pH值3.4的缓冲液体系,并反转了电极,对比N-PAGE中所用的pH值8.3的缓冲液体系,前者能使pI值在3.4-8.3之间的多肽片段都跑出条带,满足更多的实验需要,为靶向HIV-1包膜的病毒进入抑制剂的研究提供了一个方便有效的方法。