肝细胞肝癌是常见的恶性肿瘤之一，全世界每年大概有64万人被初次诊断患有HCC，其中半数以上是中国人。在中国，乙型肝炎病毒（HBV）感染导致肝硬化进而演变为HCC是其发病率骤升的首要原因，据二十世纪90年代统计结果显示，HCC已成为中国肿瘤相关致死率排名第二位的疾病。肝细胞肝癌病情进展极快，且具有发病隐匿的特点，多数患者由于在首次诊断HCC时即已出现了肝内或肝外转移，而丧失了接受根治性手术的机会；而另外一少部分患者，由于早期发现、早期诊断并接受及时治疗而获得了较长的生存时间。因此，肝细胞肝癌患者的诊断是决定患者治疗效果和生存的重要因素。至今为止，多种分子标志物用于HCC诊断，然而，它们均存在敏感度低、特异度不足的问题，因此寻找肝细胞肝癌灵敏度好、特异度高的肿瘤标志物是目前肝癌研究领域中迫切需要解决的问题。MicroRNAs（miRNAs）是一类不参与编码的小RNA分子，其在DNA完成转录之后的阶段对靶基因表达进行调节，与人体的生理活动和疾病发生过程紧密相关，特别是在肿瘤疾病中，miRNA可作为癌基因也可作为抑癌基因调控肿瘤的发生和发展。MicroRNA在不同种类的肿瘤中具有明显差异的表达模式，因此将其作为肿瘤诊断标志物或预后判断指标是非常有希望的。本课题希望通过芯片检测、PCR检测等方法寻找到一种能够用于HCC诊断和判断预后的分子标志物，主要包含以下四个部分：第一部分：收集病例资料，选择入组患者方法：使用Epidata3.0建立数据库，收集符合入组标准的肝细胞肝癌患者及慢性乙型病毒性肝炎患者临床病历资料；使用SPSS21.0进行统计分析。结果：HCC患者血清AFP值为17.80ng/ml±598.60ng/ml，明显高于CH组患者平均血清AFP值7.10ng/ml±13.10ng/ml，其间差异具有统计学意义（p=0.007）；此外，其它临床信息差异无统计学意义。结论：血清甲胎蛋白是临床应用最广的肝细胞肝癌分子标志物之一，其在多数原发性HCC患者中明显增高，但其具敏感度低、特异度不足的缺陷。肝细胞肝癌患者和慢性乙型病毒性肝炎患者的一般临床病历资料相似，具有可比性。第二部分：筛选肝细胞肝癌microRNA表达谱，选择目标基因为microRNA-139方法：应用芯片技术筛选HCC的miRNA表达谱，经分析数据和查阅文献后选择目标miRNA。结果：芯片检测结果显示，HCC患者癌组织中表达量明显降低的miRNA有：miRNA-139、miRNA-99a、miRNA-27b、miRNA-378a、miRNA-378e及miRNA-30c，而明显高表达的有：miRNA-21、miRNA-221、miRNA-148b以及miRNA-186。经慎重的商讨后，最终选择microRNA-139为后续研究的主要对象。结论：本课题芯片所获得的肝细胞肝癌的miRNA表达谱与其它已发表文献所报道的表达谱不尽一致，分析其原因可能是由于个体病例或个体样本间的异质性所致，提示我们肿瘤的发生过程是由数目繁多的基因参与并调控，具有相当的复杂性和多样性。MicroRNA-139在多种恶性肿瘤中下调表达，而在肝细胞肝癌临床研究方面尚无报道，选其为后续研究的目标基因符合本课题研究目的，具有可行性。第三部分：RT-qPCR检测多个组织及血浆标本中microRNA-139表达量方法：miRNeasyMini试剂盒提取组织标本中总RNA，BLOODmisi试剂盒提取血浆标本中总RNA，经分光光度计检测总RNA溶液纯度达标准后，使用RT-qPCR方法检测每个样本中miRNA-139的表达量。结果：相比于癌旁标本，miRNA-139在癌标本中表达明显下调；相比于CH患者的血浆标本，microRNA-139在HCC患者血浆中表达亦下调；相关分析提示，miRNA-139在肝细胞肝癌患者癌标本中与血浆标本中的表达水平具有正相关性。结论：microRNA-139在肝细胞肝癌中下调表达，同时有文献报道其在其它多种癌症中亦有同样的表现，因此我们认为miRNA-139下调表达是存在于恶性肿瘤中的普遍现象。本部分实验还发现组织和血浆中miRNA-139表达量存在正相关性，出现该结果的原因众说纷纭，但目前主流的观点认为，循环血液中的miRNA是由肿瘤相关微泡或外泌体释放而来的，同时，也正是由于微泡或外泌体的保护，使循环血液中的miRNA免受RNase的降解。第四部分：肝细胞肝癌患者血浆中microRNA-139的临床意义方法：基于31名HCC患者的临床病历资料及其血浆miRNA-139的表达量数据，使用软件SPSS21.0统计分析miRNA-139的临床意义，当相对应的p值小于0.05时认为差异存在统计学意义。结果：血浆microRNA-139可作为诊断HCC的分子标志物，尤其是当其与血清AFP联合应用时，敏感度可达90.3%、特异度可达87.1%。根据31名HCC患者血浆microRNA-139表达量高低，将≤-3.240的25名HCC患者归为低表达组，将＞-3.240的6名患者分为高表达组。统计结果提示：血浆miRNA-139表达水平与HCC患者的病理E-S分级、血清AFP值、CEA值及直接胆红素具有相关性。此外，短期生存分析提示，miRNA-139低表达组患者1年生存率为48.0%、中位生存时间为439天±50天，高表达组患者1年生存率为66.7%、中位生存时间为503天±69天，通过校正患者病理E-S分级、Child-Pugh分级、CLIP评分等因素后，发现miRNA-139高、低表达组中患者1年生存率差异具有统计学意义。结论：miRNA-139单独诊断HCC具有较高的敏感度，达到80%以上，但特异度相对较低，因此，我们将miRNA-139与AFP联合应用，使其敏感度和特异度均得到明显提升。此外，我们发现miRNA-139表达水平与病理E-S分级呈负相关性，即miRNA-139表达水平越低，E-S分级的级别越高，而病理E-S分级随着肿瘤侵袭性的增强而升高，这也说明miRNA-139在肝细胞肝癌中扮演着保护性因素的角色。最后的短期生存分析提示miRNA-139是影响HCC患者预后的保护性因素，可能在癌症发生过程中具有抑癌基因的作用。