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本研究选用麦胚为原料,采用保温孵育的方法,研究不同孵育条件及孵育液组分下麦胚肽含量和抗菌活性等的变化规律。通过培养条件和培养液组成优化,得到有利于抗菌肽累积的孵育工艺和参数,分析了孵育过程中麦胚主要成分的变化,对孵育得到的抗菌肽进行了分离纯化,同时对其结构进行了探讨。研究结果如下:
1、随着麦胚孵育时间延长,其游离氨基酸和多肽含量逐渐增加,可溶性蛋白含量先降低后升高,淀粉含量先上升后下降,还原糖含量逐渐升高后趋于平缓,粗脂肪含量逐渐降低。研磨处理可以促使麦胚中酶与底物充分接触,反应更完全,从而促进肽富集。采用正交设计考察了时间、温度和液料比三因素对麦胚孵育液中肽富集量和抗菌活性的影响。结果表明:麦胚孵育富集抗菌肽的最佳孵育条件是:时间1.0 h、温度45℃和液料比为25:1。在此条件下富集的抗菌肽抑菌圈大小为16.00 mm,是未孵育麦胚的1.23倍。
2、采用Plackett-Burman设计考察了CaCl2、ZnSO4、MgSO4、MnSO4、Nacl、KCl、抗坏血酸(Vc)、半胱氨酸(L-cysteine)和谷胱甘肽(GSH)对麦胚孵育液抗菌活性的影响,用最陡爬坡试验和响应面设计对呈显著正效应的添加物进行最佳添加量优化。结果表明:Vc、L-cysteine和GSH对抑菌圈大小呈现显著正效应;经响应面分析显示,抑菌圈大小与培养液组分浓度间的二次多项模型显著(P<0.05),可用于预测和分析麦胚孵育液的抗菌活性。优选出三种有利于麦胚孵育液的抗菌活性的添加物是Vc、L-cysteine和GSH,最佳的添加浓度分别是6.11 mmol/L,26.87 mmol/L和6.78mmol/L。在此条件下孵育的麦胚,富集的抗菌肽抑菌圈直径达到23.63 mm,是对照的1.60倍。
3、麦胚孵育液经80%乙醇处理,可除去大部分大分子的蛋白、糖等杂质,经超滤后得到四个组分,对这些组分进行抗菌活性检验,结果表明:分子量小于10 K的具有抗菌活性。分子量小于10 K的组分经SephadexG-25分离,得到三个主要组分G-25-1、G-25-2和G-25-3,抗菌活性检验表明:抗菌活性物质存在于G-25-2中;G-25-2经SephadexG-10进一步分离,得到G-10-1、G-10-2、G-10-3和G-10-4四个组分,分别进行抗菌活性检验:G-10-2具有抗菌活性。G-10-2经半制备型HPLC制得五个组分HPLC-1、HPLC-2、HPLC-3、HPLC-4和HPLC-5,抗菌活性检验表明:HPLC-2为所需抗菌肽。ESI-MS质谱分析和氨基酸组成分析表明,麦胚孵育液中HPLC-2抗菌肽分子量为456.84 Da,其氨基酸组成为Glu-Tyr-Phe。对此抗菌肽的抗菌作用进行研究得到:HPLC-2抗菌肽对革兰氏阳性细菌(枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性细菌(大肠杆菌和绿脓杆菌)均有不同程度的抑制作用,对试验所用真菌无明显抑制作用;HPLC-2抗菌肽对大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC)为500μg/ml;分离纯化得到的HPLC-2抗菌肽在100℃下加热1 h的时间内,其活性几乎没有发生变化,表明该抗菌肽具有良好的热稳定性。