临床上各种原因导致的大段骨缺损仍然是临床医生所面临的一大挑战。对大段骨缺损的传统治疗分为自体、同种异体及异种骨移植。然而这些方法或多或少都存在着一些缺点,如疼痛、出血、来源有限、病毒传播潜在风险及免疫排斥反应等。作为自体骨及同种异体骨的替代品,骨组织工程的研究有望彻底解决这一难题。自20世纪90年代Grane提出组织工程骨这一概念以来,骨组织工程领域就一直受到广泛的关注,骨缺损的修复也取得了较大的进步,各种优质的填充材料层出不穷,不仅在动物实验中证实了具有较好的骨修复能力,甚至已有一些填充材料已成功应用于临床修复骨缺损、骨不连等疾患中。具备骨诱导活性的复合生物材料是组织工程骨的一个研究热点。一些有着较强的诱导成骨活性的生长因子,如骨形态发生蛋白-2（BMP-2）,已结合于不同的生物活性材料,被美国FDA批准用于临床上促进骨折愈合及脊柱融合。然而BMP制剂存在的半衰期短、价格昂贵、可能引起免疫排斥反应等缺点,仍较大程度地限制了其在临床中的实际应用。近年来,随着现代医学和分子生物学技术的快速发展,一些学者开始将基因工程技术与骨组织工程技术相结合试图寻求另一种更优的促进骨损伤修复的新方法。Evans CH曾概括指出基因工程技术与骨组织工程技术相结合治疗骨损伤是通过将具有成骨诱导作用的基因（如BMPs基因）导入干细胞中,在干细胞内转录成mRNA并翻译成活性蛋白,通过自分泌及旁分泌的方式,刺激干细胞在支架材料中增殖、分化,从而达到促进骨修复的目的。Kang R,Ghivizzani SC等认为基因技术在骨损伤治疗中的最大优点在于使细胞内高表达的内源性BMPs蛋白能够保留其完整的天然结构,可更高效地与细胞膜上的BMPs受体结合而表现出比外源性BMPs蛋白更强的成骨诱导能力,同时高表达的内源性BMPs蛋白也可以避免外源性BMPs制备过程复杂,产量低,费用昂贵,易引起免疫排斥反应等缺点而受到一些研究者的亲睐。在基因治疗中,病毒类载体因具有致癌性、免疫原性等严重安全问题,非病毒类载体则逐渐成为基因治疗研究的热点。近年来随着骨缺损基因治疗的深入研究,各种基因载体层出不穷。其中,壳聚糖作为一种聚阳离子基因载体,因其来源广泛,价格低廉,生物相容性好,并可通过化学接枝而调控其在体内的理化性能等优点而被认为是一种较优的基因载体。研究表明[34-36],壳聚糖在酸性条件下带有正电荷,易与荷负电的DNA通过静电吸附作用凝聚成纳米级的多聚复合物（纳米粒）,而这种纳米粒能够通过空间位阻效应有效保护DNA在细胞内转运过程中不受核酸酶的降解,从而利于细胞内目的蛋白的高表达。目前随着对壳聚糖基因载体研究的深入,一些学者发现应用穿膜肽TAT、融合肽HA-2、KALA、RGD肽等对壳聚糖基因载体进行多肽修饰后,能够明显提高载基因纳米微粒的穿胞能力。研究发现,TAT、HA-2、KALA及RGD肽中均富含有精氨酸,并发现多肽修饰的纳米粒转染细胞时精氨酸起着关键的作用。骨损伤修复是一个相对较长的过程,载基因纳米粒子转染成骨前体细胞后瞬时高表达的BMP-2蛋白不足以维持整个修复过程的需求。微型包囊技术系利用天然的或合成的高分子材料作为微球的壁壳,将药物包裹成微球型胶囊。药物在囊内通过扩散、渗透及微球的降解等方式在特定的位置持续释放出来,以取得更大限度的长期发挥药效的作用。到目前已约有200多种药物采用了微型包囊技术,包括蛋白质,多肽类,基因,生长因子,抗原等都能成功地被包封制成缓释微球,从而最大限度地保护微球内部生物大分子的结构和活性,并能达到靶向及缓释给药目的,使得药物释放更可控,更安全,更有效。PELA是聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸三嵌段共聚物,作为微球囊材,在前期研究中已通过调节聚合物中PEG嵌段的分子量,投入原料的量,复乳液搅拌固化时间,乳化剂的浓度及外水相中PVA浓度,对微球的包封率及缓释效果进行了优化。本研究应用L-精氨酸通过酰胺键结合到壳聚糖骨架中,并首先利用复凝聚法制备精氨酸-壳聚糖/pBMP-2纳米粒,同时采用复乳溶剂挥发法制备了包封精氨酸-壳聚糖/pBMP-2纳米粒的PELA微囊。我们期望通过接枝精氨酸后的壳聚糖纳米粒子具有更优的入胞性能。然后应用响应面法优化的微球制备参数以得到较高包封率的PELA微囊。制备的PELA微囊其内包封精氨酸-壳聚糖/pBMP-2纳米粒。进一步研究这种微囊释放精氨酸-壳聚糖/pBMP-2纳米粒的控释性能,并通过与成骨前体细胞共培养,检测BMP-2蛋白分泌曲线。最后通过检测ALP活性、茜素红染色及Q-PCR分析其在体外的成骨诱导效能。目的：构建精氨酸修饰的精氨酸-壳聚糖共聚物,并与荷负电的pBMP-2自组装凝聚成纳米级粒子,检测其纳米粒度及Zeta电位性质。体外验证纳米粒子的入胞性能。研发出内部包封有精氨酸-壳聚糖／pBMP-2纳米粒的PELA微球,在体外探讨PELA微球的成骨诱导效能。研究这种生物活性微球的粘弹性,表征,精氨酸-壳聚糖／pBMP-2纳米粒的缓释曲线,缓释出纳米粒子的生物活性,以及体外诱导成骨前体细胞的成骨分化能力。为今后骨损伤治疗的应用提供一种新方法和新思路。方法：1精氨酸-壳聚糖/pBMP-2纳米粒的制备、表征及细胞转染性能研究将L-精氨酸及壳聚糖完全溶于pH 5.0的四甲基乙二胺/盐酸（TEMED/HCl）缓冲液中,加入1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）作为激活剂及偶联剂,氮气保护下磁力搅拌室温连续反应10h,去离子水中透析4天后冷冻干燥得到精氨酸-壳聚糖（Arg-CS）复合物,并经溴化钾压片及氘代重水溶解后行傅立叶红外光谱及核磁共振1H谱验证合成物的分子结构。通过自组装凝聚法,将Arg-CS的醋酸钠／醋酸溶液与pBMP-2的NaCl溶液,以N/P为4：1的比例快速混合,静置30mmin。透射电镜下检测精氨酸-壳聚糖/pBMP-2纳米粒（Arg-CS/pBMP-2）的粒径及表征,马尔文纳米粒度仪分析精氨酸-壳聚糖/pBMP-2纳米粒子的表面Zeta电位性质。琼脂糖凝胶电泳阻滞实验分析精氨酸-壳聚糖作为基因载体保护DNA抗DNA酶降解的能力。MC3T3-E1细胞用含10%FBS的a-MEM培养基培养,待细胞达到80%融合后传代。以2×1O5/孔加入6孔细胞培养板,细胞融合60%后进行转染。将Arg-CS/pBMP-2纳米粒（相当于每孔2.5μg的质粒pBMP-2）加入不含血清的a-MEM培养基中,以裸质粒DNA及壳聚糖/pBMP-2纳米粒为对照。于37℃、5%的C02条件下孵育6h后,加入完全培养基继续培养。转染72h的细胞荧光显微镜下观察,并将细胞消化裂解,提取蛋白行western blot分析BMP-2蛋白的表达。2包封精氨酸-壳聚糖pBMP-2纳米粒的PELA微囊的制备、表征及其缓释能力研究根据前期研究所得的优化参数[18-19]。以经典的复乳溶剂挥发法制备包封Arg-CS/pBMP-2纳米粒的PELA微囊。方法简述如下：取Arg-CS/pBMP-2纳米粒混悬液（含60gg质粒）为内水相（W1）,将300mg聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸溶解于二氯甲烷中为油相（O）。将内水相加入油相,乳化10mmin,形成初乳液（W1/O）。再将初乳液加入40 mL1.0%的聚乙烯醇溶液（W2）中,乳化10min,形成复乳液（W1/O/W2）,800r/min搅拌40min,彻底挥发二氯甲烷。微囊离心10min,洗涤3次收集,冷冻干燥后,扫描电镜观察。取上述制备的PELA微球置于4m1二氯甲烷中充分溶解微球后,加入2mlTE缓冲液充分振荡,萃取出其内的质粒基因测定PELA微球内部包封的质粒基因的含量。同时取上述制备的PELA微球放入含lml PBS的EP管中,置于37℃恒温箱内。在固定的时间点（2,4,8,12,16,22,28,35,42天）取出样品,EP管800r/min离心30分钟,吸出缓释液,储存于₂0-C,至检测时解冻,加入适量壳聚糖酶溶液,微量分光光度计于260nm波长处测定pBMP-2含量。MC3T3-E1细胞以1×105/孔接种于6孔板,用含10%FBS的a-MEM培养基培养。同时,称取30mg包封有Arg-CS/pBMP-2纳米粒的PELA微球粉末分散于培养基中,以包封CS/pBMP-2纳米粒,裸pBMP-2的PELA微球为对照,置于37℃,5% CO2培养箱中培养,于3、7、10、14、18、21天换液,上清液离心,收集。按照说明书行ELISA实验检测培养液中BMP-2的分泌含量。3包封精氨酸-壳聚糖pBMP-2纳米粒的PELA微囊体外成骨诱导效能的研究MC3T3-E1细胞以1×105/孔接种于6孔板,称取30mg包封有Arg-CS/pBMP-2纳米粒子的PELA微球分散于培养液中,分别于7天、14天用0.2%的TritonX-100裂解细胞,按照ALP检测试剂盒（南京建成）说明书操作,酶联免疫检测仪在520nm波长读取吸光度值。取诱导21天的细胞,4%多聚甲醛固定,蒸馏水洗3遍,1%茜素红37℃下染色30min,吸去染色液,于显微镜下观察钙结节。结果：1精氨酸-壳聚糖pBMP-2纳米粒的制备、表征及细胞转染性能研究精氨酸、壳聚糖及精氨酸-壳聚糖多聚物的红外光谱（FTIR）及1H核磁图谱（1H NMR）见图1-3。在精氨酸的红外谱图中,1558.53 cm-1处的吸收带是由于精氨酸的胍基所产生,而1474.47 cm-1处的吸收带是由羰基COO-的伸缩振动所引起。1136.63 cm-1和793.87 cm-1处的吸收带分别属于C-C-N键的伸缩振动和羰基COO-的弯曲振动。在壳聚糖的红外谱图中,在1655.66 cm-1处出现壳聚糖C=O酰基的弯曲振动带,1077.49 cm-1-1026.23 cm-1处出现吡喃环C-O键的伸缩振动带。在精氨酸-壳聚糖多聚物的红外谱图中,1543.65 cm-1及1149.80cm-1处出现了精氨酸的特征峰,同时也出现了壳聚糖吡喃环上的C-O键的特征性伸缩振动带,而在1462.91 cm-1处出现的吸收带是因精氨酸与壳聚糖相互反应生成的酰胺键而产生。1H NMR核磁图谱进一步显示,精氨酸-壳聚糖多聚物中同时出现精氨酸与壳聚糖的特征性吸收峰。根据以上FTIR及1H NMR结果可看出精氨酸已成功接枝于壳聚糖的骨架中。透射电镜可见,Arg-CS/pBMP-2纳米粒子呈球形,粒径较为均一。同时可见,裸质粒DNA电泳出加样孔,而Arg-CS/pBMP-2纳米粒能阻滞pBMP-2向阳极移动。加入不同浓度的DNA酶后,裸质粒DNA被降解,其泳道内条带基本消失,而Arg-CS/pBMP-2纳米粒泳道内的荧光亮度基本不变。由此可见,Arg-CS基因载体能成功与BMP-2质粒基因凝聚成纳米级粒子,并有效保护其内的质粒基因抗DNA酶降解。MC3T3-E1细胞体外转染后72h后,Arg-CS/pBMP-2纳米粒组在荧光显微镜下有较多的细胞表达绿色荧光蛋白,壳聚糖/pBMP-2纳米粒组只有少数细胞表达弱的绿色荧光,而裸质粒DNA组只有极个别的细胞表达绿色荧光蛋白蛋白阳性（图1-7）。同时,western blot显示Arg-CS/pBMP-2纳米粒组的BMP-2蛋白的表达水平明显高于壳聚糖/pBMP-2纳米粒组（p<0.05）及裸质粒DNA组（p<0.01）。2包封精氨酸-壳聚糖pBMP-2纳米粒的PELA微囊的制备、表征及其缓释能力研究扫描电镜可见微球的形态,图2-1A所示：微球呈现椭圆形或规则圆形,表面光滑、无粘连、大小分布较均匀尺寸约为43.34+15.24μm。图2-1B可见,在开始2天内有累计16.46±4.73%的pBMP-2被释放,之后pBMP-2的缓释保持在相对较平稳的速率。缓慢释放2周后,pBMP-2释放速度呈现小幅加速。缓释3周后,pBMP-2缓释速度又逐渐减慢。到实验终止时（第42天）,pBMP-2累积释放56.87±5.09%。可见,本研究制备的PELA微球能够满足长效缓释的要求。同时,测得包封率为67.49±0.85%。包封纳米粒的PELA微球与MC3T3-E1细胞共培养后分别于3、7、10、14、18、21天行ELISA检测培养液BMP-2蛋白分泌量,由图2-1,在第7天,PELA /Arg-CS/BMP-2组的BMP-2蛋白分泌达到最高48.35±3.38pg/ml,21天后BMP-2蛋白的分泌量仍能达到较高水平29.09±1.87pg/ml。3包封精氨酸-壳聚糖/pBMP-2纳米粒的PELA微囊体外成骨诱导效能的研究图3-3可见PELA/Arg-CS/pB MP-2纳米粒组的钙结节沉积明显多于其它处理组,同时ALP活性分析显示,在培养第7天,PELA/Arg-CS/pBMP-2纳米粒组的ALP活性均高于其它处理组（P<0.05）,PELA/CS/pBMP-2纳米粒组与PELA/pBMP-2组相比差异有统计学意义（P<0.05）,而PELA微球组与PELA/pBMP-2组的ALP活性差异无统计学意义（P>0.05）。到第14天,PELA/Arg-CS/pBMP-2纳米粒组的ALP活性大于PELA/CS/pBMP-2组（P<0.05）,PELA/pBMP-2组（P<0.01）和PELA组（P<0.01）,其差异有统计学意义。PELA/CS/pBMP-2组的ALP活性高于PELA/pBMP-2组,有显著统计学差异（P<0.01）。结论：本研究将精氨酸修饰的壳聚糖作为BMP-2质粒基因的载体,进而提高BMP-2基因的入胞性能及促进细胞内BMP-2蛋白的高表达水平。同时制备的包封Arg-CS/pBMP-2纳米粒子的PELA微球也实现对Arg-CS/pBMP-2纳米粒子的长效缓释,促进成骨前体细胞的成骨分化,这为其今后临床治疗骨缺损提供了重要依据。然而,活体内环境复杂多变,在体内多种因素影响下能否仍然保持其良好成骨诱导性能,尚需进一步研究以验证其有效性。