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新城疫病毒(NDV)又称亚洲鸡瘟病毒,该病毒可引起鸡、火鸡、鸵鸟、鸽子、孔雀及其它野鸟等多种禽类发病。该病1926年首次发现于英国新城,现流行于世界各国。在最近70年间,新城疫病毒流行造成了很大的经济损失,打击了许多国家的养禽业。国际兽疫局把新城疫定为必须通报的传染病。尽管常规检测新城疫病毒及其抗原的方法很多,但是检测诊断新城疫活病毒在病毒学研究方面仍具有重要意义方法。为此建立了免疫荧光法和免疫组化法两种血清学方法分别测定NDV在CEF和COS-7两种细胞中的定位,通过这两个方法不仅能快速、准确的检查NDV,而且还能够得到新城疫活病毒在细胞中的增殖和定位情况,为研究NDV的致病性提供一定的实验依据。通过高速离心和超速离心的方法对NDV进行纯化,经过检测,纯化的病毒可以用来进行免疫。鸡胚尿囊腔接种方法接种NDV F48E9强毒于9日龄的SPF鸡胚,每枚接种0.2ml,去除24h内死亡的鸡胚,取24～120h死亡的鸡胚,4℃放置12h,收集其尿囊液,用血凝实验进行鉴定,得到效价为1:26 ,-20℃保存;反复冻融3次,4℃12000r/min离心50 min,收集上清液。将上清液以4℃60000 r/min离心6h,弃上清,用少量0.01 mol/L pH7.4 PBS悬浮沉淀,-70℃保存。超离病毒用血凝实验进行鉴定,得到效价为28。用所得的病毒免疫两只青年公鸡,得到鸡抗NDV多克隆抗体,用血凝抑制试验检测,效价分别为1:27和1:28。采用饱和硫酸铵盐析、透析、Sephadex G-200柱凝胶层析法从鸡血清中获得IgG,经SDS-PAGE电泳和免疫电泳鉴定,纯化后的IgG达到电泳纯,可以用来免疫。Folin-酚法测IgG浓度,绘制了纯化过程的洗脱曲线。纯化的鸡血清IgG用于制备兔抗鸡血清IgG多克隆抗体。采用琼扩试验和Western Blot对兔抗鸡血清IgG多克隆抗体进行了鉴定,琼扩试验测得多克隆抗体的效价为1:16,Western Blot显示出多抗与IgG的重链和轻链反应的两条特异性条带。采用上述方法纯化兔抗鸡IgG多克隆抗体血清,经SDS-PAGE电泳鉴定,纯化后的IgG达到电泳纯。Folin-酚法测IgG浓度,绘制了纯化过程的洗脱曲线。纯化的兔IgG用于制备酶标记兔抗鸡IgG抗体,采用过碘酸钠氧化法将HRP标记到兔抗鸡IgG血清IgG上,得到酶标记兔抗鸡IgG抗体。对所得到酶标记兔抗鸡IgG抗体的使用效果以及酶结合物使用稀释度进行测定。发现酶标记兔抗鸡IgG抗体抗的使用效果比较好,可以进行下面试验。所得的酶标记兔抗鸡IgG抗体抗使用稀释度为1:4000。本研究用上述所得到的抗原、鸡抗NDV抗体和酶标记兔抗鸡IgG抗体建立了快速检测NDV在CEF和COS-7细胞中的定位的免疫酶标细胞化学法。通过方正法优化出以下最佳反应条件。确定该实验用4%多聚甲醛做固定剂结果较好,病毒接种量为100×TCID50,细胞孵育24h,鸡抗NDV抗体在4℃反应过夜,按1:50进行稀释,酶标记兔抗鸡IgG抗体在37℃反应30min,按1:200进行稀释,显色时间为避光显色20min。本研究还建立了快速检测NDV在CEF和COS-7细胞中的定位的免疫荧光细胞化学法。通过方阵法优化出以下最佳反应条件。固定液用4%的多聚甲醛,病毒接种时间为24h,病毒接种量为100×TCID50,鸡抗NDV抗体稀释度为1:100,酶标记兔抗鸡IgG抗体稀释度为1:300,鸡抗NDV抗体4℃孵育过夜,荧光标记的兔抗鸡IgG抗体37℃反应30min,5%的小牛血清室温封闭1h。