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本研究的目的是实现马铃薯卷叶病毒(PLRV)外壳蛋白(CP)突变基因在大肠杆菌中的高效表达,并用表达的融合蛋白作为抗原制备抗血清,为进行PLRV的ELISA检测及组装ELISA检测试剂盒奠定基础。主要的研究结果如下:
1、采用人工合成DNA的方法对马铃薯卷叶病毒外壳蛋白(CP)基因的密码子进行了突变。合成了含有PLRV-CP基因第39-624核苷酸的639bp的Bsp1407I-MssI片段,将该基因第52-177这段序列(126bp)中精氨酸的稀有密码子进行了同义与错义突变。合成的DNA片段连接在pMD19-T载体上获得了重组质粒pMD-LRCP2。
2、构建了密码子突变基因(LRCP2)的原核表达载体。将本实验室已构建的PLRV-CP缺失突变基因的原核表达载体pBAD-LRCP-126进行Bsp1407I与MssI双酶切后回收4.5Kb的片段,pMD-LRCP2同样双酶切后回收0.64Kb的片段,两个片段连接获得了重组质粒pBAD-LRCP2,即获得了突变基因LRCP2的原核表达载体。测序结果显示基因的突变符合实验设计的要求、基因与载体的连接正确。
3、实现了突变基因(LRCP2)的原核表达。在37℃,大肠杆菌工程株TOP10(pBAD-LRCP2)用0.2%阿拉伯糖诱导培养4h后,SDS-PAGE显示蛋白图谱上有一条36 kDa的诱导表达蛋白条带,其大小与预期的融合蛋白相符,表明该突变基因实现了在PBAD驱动下的原核诱导表达。
4、对PLRV-CP缺失突变基因进行原核表达获得了大量融合蛋白。TOP10(pBAD-LRCP-126)经诱导、蛋白提取与镍离子亲和层析获得了大量高纯度的融合蛋白。
5、制备出了融合蛋白特异性抗血清。以纯化的融合蛋白为抗原免疫家兔制备出了特异性抗血清,间接ELISA检测显示效价可达1∶12000。
6、对PLRV进行了间接ELISA检测。用制备的抗血清对感染PLRV的病叶组织进行间接ELISA检测,结果呈阳性,结果表明制备的抗血清可用于PLRV的ELISA检测。