马铃薯卷叶病毒CP基因的突变、原核表达及抗血清制备

来源 :青岛农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:java_flash
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
本研究的目的是实现马铃薯卷叶病毒(PLRV)外壳蛋白(CP)突变基因在大肠杆菌中的高效表达,并用表达的融合蛋白作为抗原制备抗血清,为进行PLRV的ELISA检测及组装ELISA检测试剂盒奠定基础。主要的研究结果如下:   1、采用人工合成DNA的方法对马铃薯卷叶病毒外壳蛋白(CP)基因的密码子进行了突变。合成了含有PLRV-CP基因第39-624核苷酸的639bp的Bsp1407I-MssI片段,将该基因第52-177这段序列(126bp)中精氨酸的稀有密码子进行了同义与错义突变。合成的DNA片段连接在pMD19-T载体上获得了重组质粒pMD-LRCP2。   2、构建了密码子突变基因(LRCP2)的原核表达载体。将本实验室已构建的PLRV-CP缺失突变基因的原核表达载体pBAD-LRCP-126进行Bsp1407I与MssI双酶切后回收4.5Kb的片段,pMD-LRCP2同样双酶切后回收0.64Kb的片段,两个片段连接获得了重组质粒pBAD-LRCP2,即获得了突变基因LRCP2的原核表达载体。测序结果显示基因的突变符合实验设计的要求、基因与载体的连接正确。   3、实现了突变基因(LRCP2)的原核表达。在37℃,大肠杆菌工程株TOP10(pBAD-LRCP2)用0.2%阿拉伯糖诱导培养4h后,SDS-PAGE显示蛋白图谱上有一条36 kDa的诱导表达蛋白条带,其大小与预期的融合蛋白相符,表明该突变基因实现了在PBAD驱动下的原核诱导表达。   4、对PLRV-CP缺失突变基因进行原核表达获得了大量融合蛋白。TOP10(pBAD-LRCP-126)经诱导、蛋白提取与镍离子亲和层析获得了大量高纯度的融合蛋白。   5、制备出了融合蛋白特异性抗血清。以纯化的融合蛋白为抗原免疫家兔制备出了特异性抗血清,间接ELISA检测显示效价可达1∶12000。   6、对PLRV进行了间接ELISA检测。用制备的抗血清对感染PLRV的病叶组织进行间接ELISA检测,结果呈阳性,结果表明制备的抗血清可用于PLRV的ELISA检测。
其他文献
松材线虫病是一种由松材线虫引起的林业毁灭性病害,在我国多个省市严重发生,造成了巨大经济损失。迄今为止,国内外对松材线虫病开展了大量的研究,但针对松材线虫本身的基础性
本研究选取了鼎湖山南亚热带森林演替早期:马尾松(Pinus massoniana),中期:荷木(Schima superba)、黧蒴(Castanopsis fissa)和顶级阶段的优势树种:黄果厚壳桂(Cryptocarya concinna)、肖
蚕是重要的经济昆虫,同时也是鳞翅目的模式昆虫,蚕丝产业在我国拥有5000多年的悠久历史,在社会经济文化生活中占有重要地位。同时,家蚕功能基因组学的研究将为全面、准确地了解家