阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种多发生在老年、以认知功能障碍为主要临床表现的神经退行性疾病。迄今为止,关于AD确切的发病机制仍不清楚,针对AD的治疗措施基本是改善认知的症状性治疗,而不能阻止或逆转病情进展。目前,血糖异常升高和糖尿病已被认为是痴呆和AD的独立危险因素,AD患者脑细胞葡萄糖与能量代谢显著降低、而且明显早于临床症候和特征性病理损害的形成。动物实验研究也提示脑细胞葡萄糖代谢异常可能是AD病理生理发生的关键因素,能量代谢下降影响脑功能状态与线粒体功能,从而导致线粒体活性氧分子产生增加。进一步研究发现,AD患者与脑细胞葡萄糖和能量代谢障碍有关的酶活性异常中,仅以硫胺素作为辅酶的α-酮戊二酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶和转酮醇酶等活性下降最为明显,且丙酮酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶的活性下降与AD临床病情评定等级高度相关。流行病学调查显示,老年人群本身容易导致硫胺素缺乏,而且缺乏程度与认知功能下降具有显著相关性。另外,Gold等人的研究发现,血硫胺素水平降低与散发性AD发病有关,而与帕金森病无关。动物实验研究也显示,硫胺素缺乏促进APP/PS1双转基因模型小鼠脑内Aβ沉积。这提示机体硫胺素缺乏和/或代谢异常及硫胺素依赖的、与氧化代谢相关的线粒体酶活性下降可能与AD的发生发展密切相关。因此,我们认为硫胺素缺乏或代谢异常诱发的α-酮戊二酸脱氢酶和丙酮酸脱氢酶活性下降、线粒体糖代谢和能量代谢障碍可能是AD发病的重要危险因素,可能直接参与AD特征性病理改变如tau蛋白异常磷酸化和Aβ沉积等。那么,硫胺素缺乏是否诱导正常野生型小鼠脑内Aβ沉积等AD特征性病理损害形成呢?由于临床试验已经证实硫胺素并不能治疗或改变AD病程进展,生物利用度更好和生理作用更为强大的硫胺素脂溶性衍生物是否可以改善线粒体功能与脑细胞能量代谢状况、拮抗氧化损伤、减少AD特征性病理损害呢?由此我们利用8周龄正常野生型C57小鼠制备硫胺素缺乏动物模型,探讨硫胺素缺乏对脑内Aβ沉积、tau蛋白磷酸化的影响;利用20周龄APP/PS1双转基因模型小鼠,给予8周处理因素,观察苯磷硫胺是否可提高APP/PS1双转基因模型小鼠学习记忆能力及改善脑内Aβ沉积、tau蛋白异常磷酸化等病理改变。第一部分硫胺素缺乏引起脑内Aβ沉积和tau蛋白异常磷酸化的实验研究目的:探讨硫胺素缺乏对脑内Aβ沉积、tau蛋白磷酸化的影响。方法:硫胺素剥夺饮食结合腹腔注射吡啶硫胺制作硫胺素缺乏动物模型,正常对照组给予正常饮食及腹腔注射生理盐水。造模13d后取脑,行HE染色观察两组动物脑内易损区域病理改变,免疫组织化学染色检测脑内Aβ沉积、tau蛋白磷酸化及β-分泌酶的表达情况。结果:HE染色显示硫胺素缺乏模型组小鼠内侧丘脑出现典型的对称性针尖样出血;免疫组化显示模型组小鼠皮层、海马及丘脑均出现Aβ沉积,且丘脑Aβ沉积较皮层及海马更为明显,tau蛋白磷酸化及β-分泌酶的阳性细胞数显著增加。正常对照组小鼠HE染色脑内未见病理损伤,皮层、海马及丘脑均未发现Aβ沉积,tau蛋白磷酸化及表达β-分泌酶的阳性细胞数均明显低于硫胺素缺乏模型组,两组差异有统计学意义(P<0.05)。结论:硫胺素缺乏可引起脑内Aβ沉积、tau蛋白磷酸化增加等AD特征性的病理改变,且Aβ沉积可能与上调β-分泌酶的表达有关。第二部分苯磷硫胺改善APP/PS1双转基因模型小鼠行为学及阿尔茨海默病相关病理改变的实验研究目的:观察苯磷硫胺是否改善APP/PS1双转基因模型小鼠学习记忆能力下降及脑内Aβ沉积、tau蛋白异常磷酸化等病理改变方法:20周龄雄性APP/PS1双转基因模型小鼠,随机分为苯磷硫胺高剂量组(200mg/kg)、苯磷硫胺中剂量组(100mg/kg)、苯磷硫胺低剂量组(50mg/kg)、石衫碱甲组(66.7ug/kg)、呋喃硫胺组(100mg/kg)、空白对照组。各组APP/PS1双转基因小鼠以0.2ml/10g的药物容积按应给予剂量的药液灌胃(i.g)给药,每天1次,连续8w。最后1次给药1h后,每组半数动物进行Morris水迷宫训练,其余半数动物经水合氯醛麻醉,生理盐水、多聚甲醛依次灌注后取脑。免疫组化染色观察脑内Aβ沉积、tau蛋白磷酸化情况。结果:第5天撤台实验中,200、100mg/kg苯磷硫胺组及石杉碱甲组明显增加了小鼠穿越平台的次数,与模型组相比P<0.01;50mg/kg苯磷硫胺组和呋喃硫胺组虽然也增加了小鼠的穿台次数,但与模型组相比无统计学的显著性差异。在第Ⅳ象限游泳的路程和时间指标上,与模型组相比,200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg苯磷硫胺组及石杉碱甲组均明显增加了小鼠在平台周围活动的路程和时间,说明以上各组药物明显改善了动物寻找平台的学习记忆状况;呋喃硫胺组没有明显改变上述两个指标。空白对照组小鼠脑内的Aβ沉淀斑点较多;石杉碱甲和呋喃硫胺给药组脑内的Aβ沉淀斑点数量与空白对照组相比无明显差异;50mg/kg的苯磷硫胺减少了AD小鼠脑内的Aβ沉淀斑点数量,与空白对照组相比P<0.05;100、200mg/kg的苯磷硫胺组小鼠脑内的Aβ沉淀斑点镜下直观均明显减少,统计结果显示P<0.01。应用p-tau(Ser396)抗体行免疫组化染色半定量方法检测脑内tau蛋白磷酸化情况。在200倍镜下计数皮层p-tau阳性的细胞个数,发现空白对照组小鼠脑内p-tau阳性的细胞个数较多,呋喃硫胺给药组脑内的p-tau阳性的细胞个数与空白对照组相比无明显差异;石杉碱甲组脑内的p-tau阳性的细胞个数少于空白对照组,P<0.05;50、100、200mg/kg的苯磷硫胺组小鼠脑内的p-tau阳性的细胞个数镜下直观均明显减少,与空白对照组相比,统计结果显示P<0.01。结论:苯磷硫胺显示出明显改善APP/PS1双转基因模型小鼠的学习记忆能力及减少脑内Aβ沉积、tau蛋白磷酸化等病理改变的作用。