目的:近20年来冠脉介入技术（Percutaneous coronary intervention,PCI）的普及使心梗患者预后明显改善,但是心梗后心脏破裂（Post-infarction cardiac rupture,CR）的发生仍然没有得到根本上的遏制,因此,探索并发现心脏破裂的防治手段对于目前心血管疾病临床诊疗有着里程碑式的意义。本课题组前期大动物和小动物研究表明:中药通心络（Tongxinluo superfine powder,TXL）主要激活PKA/eNOS信号通路保护急性心肌梗死和缺血再灌注（Myocardial ischemia/reperfusion injury,MIRI）后心肌微血管内皮（Cardiac microvascular endothelial cells,CMEC）,同时减轻炎症细胞浸润和功能活化并减少心肌水肿（Myocardial edema）和心肌内出血（Intramyocardial hemorrhage）;他汀类药物（Atorvastatin,Ator）降脂的同时也表现出多效性,前期实验证明他汀类药物使用后心肌梗死区以及梗死周边区炎症细胞浸润明显减少,心肌和循环内炎症因子表达水平也显著下调,促进心肌修复从而减少急性心肌梗死后心肌梗死面积;同时,尼可地尔（Nicorandil,Nico）作为一种冠心病防治常用的药物,体外实验也表现出对心血管内皮细胞屏障的保护以及对炎症细胞尤其是巨噬细胞的活化抑制。本科学研究的主要目的是:（1）发现并验证通心络、负荷量他汀和尼可地尔药物组合（下称“心三联”）可以有效降低急性心肌梗死后心脏破裂的发生风险;（2）明确急性心肌梗死病理学特征和主要的发生进展时间;（3）探索药物组合预防急性心肌梗死后心脏破裂的主要靶细胞以及共有的主要作用机制;（4）更加深入地阐述影响急性心肌梗死后心脏破裂发生的TRAF6/NF-κB p65/C/EBPβ通路的上游调控机制。方法:在SPF级雄性8周龄C57 bl/6N小鼠个体上构建急性心肌梗死模型,模型构建后24小时进行超声心动图检测,将实验造模不成功未发生心肌梗死的小鼠个体排除出本实验,将小鼠随机分为不同干预组和对照组,不同的灌胃干预14天,在适宜的环境中饲养和观察手术后的C57小鼠14天,每天到鼠房中观察动物2次,将死亡的小鼠实验个体取出并解剖观察,心脏破裂的诊断标准为大体观上胸腔内血块和心肌裂伤,将刚刚死亡尚有余温的小鼠尸体取材,病理切片苏木素-伊红染色结果显示为心肌破损的也可以诊断为心脏破裂,记录、统计并绘制14天内小鼠Kaplan-Meier生存曲线并统计心肌梗死后每天的小鼠心脏破裂频数;在急性心肌梗死后第3天、第7天分别对小鼠进行活体取血,测量小鼠心梗后循环内炎症因子,如肿瘤坏死因子α（Tumornecrosis factor-α,TNF-α）、白细胞介素 6（Interleukin-6,IL-6）、γ干扰素（Interferon-γ,IFN-γ）和分泌型金属基质蛋白酶家族,如金属基质蛋白酶2（Matrixmetallopeptidase 2,MMP2）、金属基质蛋白酶9（Matrix metallopeptidase 9,MMP9）表达水平;随机从各组小鼠中选取6只在心梗后第4天取材,用Western Blot方法生化检测心肌梗死以及其周边区心肌组织中巨噬细胞活化通路蛋白,如肿瘤坏死因子受体相关因子6（Tumor necrosis factor receptor-associated factor-6,TRAF6）、核转录因子-KappaB p65（Nuclear factor-kappaB p65,NF-κB p65）、CCAAT 增强子结合蛋白 β（CCAAT/enhancer-binding protein beta,C/EBPβ）以及其下游的 MMP2 和 MMP9表达,检测心肌组织中细胞外基质蛋白,如Ⅰ型胶原纤维（Collagen I,COLl）、Ⅲ型胶原纤维（Collagen Ⅲ,COL3）、层黏连蛋白（Laminin α2）、聚集蛋白（Agrin）水平,两者结合可分析心梗后心肌组织细胞间基质的分解和修复情况,检测心肌组织中M1型巨噬细胞生物标志物F4/80、CD11b、iNOS的表达以显示M1巨噬细胞在梗死区心肌组织内浸润情况,同时利用组织免疫性荧光染色技术标定巨噬细胞在梗死周边区心肌组织内的数量和分布;为了探究药物预防急性心梗后心脏破裂上游涉及的基因表达调控的相关机制,对急性心肌梗死4天的梗死心肌组织和经过单药干预的梗死心肌组织进行转录组测序并验证其高通量测序结果。提取6-8周龄雄性C57小鼠骨髓来源巨噬细胞,培养未成熟的Mφ巨噬细胞,用细胞流式技术鉴定细胞样本中F4/80+细胞比例。将培养成熟的巨噬细胞分别接种入96孔板中,分别加入含有不同药物浓度的完全培养基中培养48小时,用CCK-8方法测定细胞活力,确定药物干预的用量;借助transwell小室和吉姆萨染色评价不同药物及其组合对巨噬细胞侵袭能力的影响;以Mφ巨噬细胞为阴性对照,以加入脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）和及γ干扰素（gamma-interferon,IFN-y）刺激的M1巨噬细胞为阳性对照,对不同药物干预的巨噬细胞转染miRNA inhibitor并检测各组中巨噬细胞MMP9和TRAF6表达水平以来验证不同miRNA在对应药物作用机制中对TRAF6表达的调控作用,随后,分别对药物联合预处理的M1巨噬细胞转染TRAF6和C/EBPβ过表达质粒以及p65核转位抑制剂BAY-17来验证TRAF6/NF-κB p65/C/EBPβ信号通路是三种药物的共同的核心作用机制;为探究转录因子NF-κB p65和C/EBPβ结合对MMP9基因表达调控的影响,我们应用免疫共沉淀技术和双荧光素酶报告基因加以检测和证明。结果:新型药物组合“心三联”可以显著下降急性心肌梗死后心脏破裂的发病风险并改善心肌梗死早期的生存率,而药物单独使用和两药组合在降低心脏破裂发生率和急性心肌梗死早期死亡率方面较急性心梗非治疗组无统计学显著;应用药物干预后不论是心梗后第3天或者是第7天循环内金属基质蛋白酶和炎症因子水平都有不同程度的改善,且以药物组合“心三联”抑制效果最为明显;在心肌组织水平上,联用通心络、负荷量他汀和尼可地尔可最为有效地通过抑制TRAF6介导的下游炎症相关转录因子NF-κB p65和C/EBPβ向巨噬细胞核内转移,降低梗死周边区心肌组织的金属基质蛋白酶家族表达活性,并减少M1型巨噬细胞过度渗出所造成的过度炎症反应和心肌细胞外基质,如Ⅰ型（Collagen Ⅰ）、Ⅲ型胶原纤维（Collagen Ⅲ）,层黏连蛋白（Laminin）和聚集蛋白（Agrin）过度溶解;通过对不同单药心梗小鼠心肌组织测序,数据库比对分析,生物信息学分析和后续的巨噬细胞转染实验验证,我们发现并阐述了通心络、阿托伐他汀和尼可地尔分别可通过上调miR-299b-3p、miR215-5p、miR122-5p调控并抑制TRAF6表达水平,而TRAF6及其下游信号通路也是三种药物减轻梗死区心肌细胞外基质分解并预防心脏破裂的共有核心机制。通过对动物心肌组织病理免疫荧光染色可知,通心络、阿托伐他汀和尼可地尔都可以降低心肌梗死周边区巨噬细胞的渗出以及巨噬细胞向心肌细胞外基质释放MMP9的强度水平,同时对于上述炎症反应的抑制作用以三药联合干预为最佳,体外细胞实验也显示新型药物组合“心三联”可以有效抑制巨噬细胞的侵袭性,与体外实验结果相互印证;“心三联”处理对于巨噬细胞MMP9表达的抑制作用能够被TRAF6过表达阻断,但是分别只促进C/EBPβ或NF-κB p65入核都不能完全阻断三联用药对M1型巨噬细胞MMP9的下调作用;通过免疫共沉淀技术我们再次验证NF-κB p65和C/EBPβ可发生结构域的结合,且双荧光素酶报告基因检测发现NF-κB p65和C/EBPβ单独入核对MMP9基因表达上调作用比较有限。结论:新型药物组合能够有效改善急性心肌梗死短期死亡率,联合口服中药通心络、负荷他汀和尼可地尔可以最为显著地减少急性心肌梗死后炎症反应以及巨噬细胞过度浸润所造成的心肌细胞外基质分解,从而增加急性心肌梗死后心室壁抗张强度,最终预防急性心肌梗死后短期的心脏破裂。主要机制为不同药物上调microRNAs并同时抑制巨噬细胞中TRAF6表达从而阻碍NF-κB p65和C/EBPβ入核并直接导致MMP9基因转录表达大幅度下调,最终减轻炎症和细胞外基质分解。目的:程序性细胞死亡,如凋亡（Apoptosis）、焦亡（Pyroptosis）、坏死（Necrosis）、铁死亡（Ferroptosis）坏死性凋亡（Necrotic apoptosis）在胚胎发育、组织稳态和免疫等多种生理病理过程中发挥着重要作用。铁死亡是一种新的非凋亡细胞死亡形式,通过铁依赖机制对磷脂膜进行氧化修饰,近年来铁死亡相关机制和信号通路被证实参与多种心血管疾病（Cardiovascular diseases,CVDs）,如动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）、急性心肌梗死、心肌缺血再灌注损伤、心肌病、心力衰竭（Heart failure,HF）中的发生与进展。急性心肌梗死后心肌细胞坏死崩解后,多种炎症免疫细胞,尤其是巨噬细胞会迅速突破崩解的微血管内皮屏障浸润入心肌组织吞噬坏死的细胞和细胞碎片,同时心肌成纤维细胞（Cardiac fibroblasts,CFs）会在细胞因子的诱导趋化作用下大量募集进入心肌损伤区,并活化为肌成纤维细胞（Myofibroblast）参与心肌梗死后心肌组织修复,由于心肌梗死后梗死区心肌组织微环境会充斥大量炎症细胞因子和脂质过氧化产物,过度炎症反应和脂质过氧化可能会导致心肌成纤维细胞铁死亡阻碍心肌修复,从而造成心梗后心脏破裂的发生。前期研究证明,中药通心络、阿托伐他汀和尼可地尔都可以显著改善梗死区心肌炎症微环境并降低脂质过氧化和氧化应激强度,同时氧化应激（Oxidative stress,OS）过度也是心肌梗死后心脏破裂的发生的重要致病机制,第一部分研究表明,三种药物都可以不同程度降低循环内γ干扰素和白细胞介素6水平,且多药联用可累加降低白细胞介素6与γ干扰素水平,现有实验证明白细胞介素6和γ干扰素可以诱导细胞铁死亡,综上,本科学研究的主要目的是:（1）证明新型药物组合（通心络、负荷量他汀和尼可地尔）可以显著抑制心肌梗死急性期梗死区心肌组织铁死亡和循环内脂质过氧化水平;（2）明确不同药物对巨噬细胞共培养心肌成纤维细胞铁死亡和脂质过氧化的抑制作用及信号通路。方法:构建小鼠急性心肌梗死模型,术后24小时进行动物超声检测,将未发生心肌梗死的小鼠排除出本实验,将小鼠随机分为不同干预组和对照组,不同的灌胃干预14天,在适宜的环境中饲养和观察手术后的C57小鼠14天,每天到鼠房中观察动物2次,将死亡的小鼠实验个体取出并解剖观察,记录、统计并绘制14天内小鼠Kaplan-Meier生存曲线并统计心肌梗死后每天的小鼠心脏破裂频数;在急性心肌梗死后第3天、第7天分别对小鼠进行活体取血,测量小鼠心梗后循环内氧化应激指标水平,如丙二醛（Malondialdehyde,MDA）、超氧化物歧化酶1（Superoxide dismutasel,SOD1）;随机从各组小鼠中选取6只在心梗后第4天取材,用Western Blot方法生化检测心肌梗死以及其周边区心肌组织中铁死亡相关通路蛋白,如谷胱甘肽过氧化酶4（Glutathione peroxidase 4,GPX4）、铁死亡抑制蛋白1（Ferroptosis suppressor protein 1,FSP1）、谷氨酸/胱氨酸转运体（Cystine/Glutamate Transporter,xCT）、p53的表达,同时免疫荧光检测心肌组织中脂质过氧化代谢物4-羟基壬醛（4-Hydroxynonenal,4-HNE）的水平。提取6-8周龄雄性C57小鼠骨髓来源巨噬细胞,培养未成熟的MΦ巨噬细胞,用细胞流式技术鉴定细胞样本中F4/80+细胞比例,提取小鼠乳鼠心肌成纤维细胞并用流式细胞术鉴定细胞样本中Vimentin+细胞比例。将提取出的心肌成纤维细胞培养传代至P2后,分别接种入96孔板中,分别加入含有不同药物浓度的完全培养基中培养48小时,用CCK-8方法测定细胞活力,确定药物干预的用量;将巨噬细胞和心肌成纤维细胞分别接种进入transwell小室和细胞培养板,给予不同的干预放入3%氧气的低氧培养箱培养48小时,检测各共培养体系中MDA水平;随后,收集心肌成纤维细胞,用Western Blot技术检测细胞中铁死亡相关蛋白（GPX4、xCT、FSP1、p53）表达水平,用流式细胞技术借助于FerroOrange荧光探针和C11 BODIPY 581/591脂质过氧化探针检测各组中心肌成纤维细胞中亚铁离子和脂质过氧化水平,用CCK-8检测法检测心肌成纤维细胞活性。结果:新型药物组合“心三联”可以显著下降急性心肌梗死后心脏破裂的发病风险并改善心肌梗死早期的生存率;应用药物干预后,心梗第3天、第7天血液循环内脂质过氧化和氧化应激水平都有不同程度的改善,且以药物组合“心三联”抑制效果最为明显;在心肌组织水平上,联用通心络、负荷量他汀和尼可地尔可最为有效地抑制心肌组织铁死亡和脂质过氧化;在细胞实验证明,阿托伐他汀主要通过上调共培养心肌成纤维细胞中GPX4通路抑制细胞铁死亡,而通心络和尼可地尔可通过同时激活GPX4和FSP1通路抑制心肌成纤维细胞铁死亡;流式细胞术和CCK-8检测结果显示,三种药物联用可以最为有效地降低共培养心肌成纤维细胞亚铁离子和脂质过氧化水平从而抑制细胞铁死亡。结论:新型药物组合能够通过改善急性心肌梗死短期死亡率,联合口服中药通心络、负荷他汀和尼可地尔可以最为显著地减减轻急性心肌梗死后心肌组织脂质过氧化和铁死亡;药物联合干预可有效上调GPX4和FSP1信号通路保护炎症和低氧微环境中的心肌成纤维细胞免于铁死亡和脂质过氧化所致的细胞活性下降。