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蓝藻 NDH-1L复合体位于类囊体膜上,它参与着一系列重要的生化反应,如围绕光系统 I(PSI)的环式电子传递(NDH-CET)和细胞呼吸。在结构上,蓝藻NDH-1L类似于大肠杆菌呼吸电子传递链上的NADH醌氧化还原酶(也称Complex I),均为保守的“L”型结构,该结构可分为亲水臂和疏水臂两部分。但在进化过程中,蓝藻 NDH-1L膜臂中增加了许多光合生物特有的(Oxygenic photosynthesis-specific)亚基,如NdhP和NdhQ,它们能共同稳定NDH-1L。在大肠杆菌NDH-1复合体中,人们也发现了其膜亚基NuoL的羧基端是稳定复合体结构所必需的。那么在新亚基出现的情况下,蓝藻中与大肠杆菌NuoL同源的NdhF1,在稳定NDH-1L结构的功能上是否发生了改变?根据前人的研究结果, NdhP的羧基端在稳定NDH-1L结构中也发挥着重要的作用,那么NdhF1与NdhP的羧基端是否共同稳定着NDH-1L的结构?本研究通过反向遗传学等研究方法,深入探究了NdhF1在稳定复合体结构上的功能以及与NdhP之间的关系。具体研究结果总结如下: (1)我们运用同源重组的方法构建了集胞藻6803(Synechcoystis sp. strain PCC6803)的ndhF1羧基端缺失突变株(ndhF1ΔC)及 ndhF1完全缺失突变株(ΔndhF1)。通过蓝绿温和凝胶电泳(BN-PAGE)以及蛋白免疫印迹(Western blot)等技术分析,我们发现在ndhF1ΔC的类囊体膜上仍能检测到NDH-1L。相比于野生型(WT)藻株类囊体膜上的NDH-1L的积累量,ndhF1ΔC类囊体膜上的NDH-1L瓦解了一半以上,其瓦解程度与ΔndhF1相似。以上结果说明,NdhF1仅承担部分稳定NDH-1L的功能,其羧基端是发挥稳定作用的关键区域。 (2)为了验证NdhF1羧基端缺失对NDH-1L生理功能的影响,我们还检测了野生型和突变株的叶绿素荧光、光系统I的反应中心P700的氧化还原状态以及细胞呼吸耗氧的速率。我们的研究结果表明, ndhF1羧基端缺失后降低了NDH-1L介导的围绕光系统 I的环式电子传递和细胞呼吸的活性,而大肠杆菌NuoL羧基端缺失仅影响了细胞呼吸的活性。以上结果说明,蓝藻NdhF1与细菌NuoL在功能上存在着差异。 (3)我们进一步构建了集胞藻6803的ndhF1和ndhP双羧基端缺失突变株(ndhF1ΔC/ndhPΔC)以及ndhF1和ndhP双缺失突变株(ΔndhF1/ΔndhP)。随后,我们通过BN-PAGE以及Western blot等技术分析发现,ndhF1ΔC/ndhPΔC类囊体膜上的NDH-1L积累量同样远少于WT,其瓦解程度与在ΔndhF1/ΔndhP中检测到的结果类似,但仍然没有完全瓦解。以上结果说明NdhF1与NdhP并不是共同稳定NDH-1L,暗示着它们在稳定复合体结构中扮演着相似的角色。 综上所述,本研究证实了NdhF1在稳定复合体结构上的功能不同于NuoL。NdhF1羧基端缺失除了损伤细胞呼吸活性以外,还下调了藻细胞中围绕光系统I的环式电子传递活性,这更加地说明 NdhF1在结构和功能上有别于NuoL。而NdhF1与NdhP同时缺失后仍有少量NDH-1L残留在膜上,据此我们推测NdhF1与NdhP在稳定NDH-1L的功能上是冗余的,NdhF1可能与NdhQ共同形成一种不同于细菌的稳定蓝藻NDH-1L复合体结构的新机制。