金黄色葡萄球菌早期分泌系统外分泌蛋白A的分子克隆及免疫特征研究

来源 :广州医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ry0205
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目的:  金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是人类化脓性感染中最常见的致病菌。金黄色葡萄球菌主要通过产生多种毒力因子致病,常见的毒力因子包括肠毒素、溶血素、凝固酶、耐热核酸酶、溶纤维蛋白酶、透明质酸酶、杀白细胞素等。Es xA为金黄色葡萄球菌分泌的一个重要毒力因子,可以引起宿主脓肿的发生,另外 Es xA蛋白可通过易位子穿过宿主细胞膜,进入细胞内,逃避宿主机体免疫应答,同时分泌或协同多种毒力因子引起宿主细胞的溶解凋亡。本研究通过对金黄色葡萄球菌进行 PCR扩增目的 EsxA基因,构建重组质粒并进行基因序列分析、蛋白的原核表达、纯化;并检测患者血清 EsxA特异性 IgG, IgG1,IgG2;构建金黄色葡萄球菌感染小鼠模型,分离小鼠脾细胞,观察其与EsxA蛋白体外共培养时细胞因子IFN-γ、IL-4的水平变化,探讨金葡感染中EsxA相关免疫特性,为其疫苗研究奠定基础。  方法:  根据 GenBank中 EsxA的序列,设计特异性引物,以临床确诊为金葡菌的DNA为模板PCR扩增EsxA基因,PC R产物纯化后用EcoRI、XhoI酶切,连接到pET-28a(+)载体,转化到大肠杆菌感受态BL21(DE3),对质粒进行双酶切鉴定和基因测序鉴定。用IPTG诱导表达重组蛋白,His标签单克隆抗体进行免疫印迹证实重组蛋白的表达。用His柱纯化重组蛋白,Western blot分析其免疫原性。使用纯化蛋白包被ELISA反应板,检测金黄色葡萄球菌感染患者血清EsxA特异性IgG,IgG1及IgG2水平。构建金黄色葡萄球菌感染的小鼠模型,取其脾细胞进行体外培养,分别用EsxA蛋白及植物血凝素(PHA)刺激,检测细胞培养液上清的IFN-γ,IL-4水平。  结果:  用临床鉴定为MRSA的菌株基因组为模板,PCR扩增EsxA基因,基因大小为294bp;重组的pET-28a-EsxA基因经双酶切鉴定可见目的片段,基因测序结果显示EsxA在正确阅读框内,起始于ATG,终止于TAA,预测分子量为11036.2,等电点为4.61。基因同源性分析显示其与 GenBank报道的金黄色葡萄球菌2395 USA500株(菌株序列号为CP:007499.1)对比同源性达到99.6%。IPTG诱导后SDS-PAGE电泳,pET-28a(+)-EsxA/BL21在相应分子量14.5kDa可见融合蛋白,免疫印迹可见目的蛋白。ElISA结果显示金葡菌感染病人EsxA特异性IgG,IgG1, IgG2 OD值分别为(0.3286±0.293),(0.187±0.216),(0.161±0.207)。感染金葡菌儿童和健康儿童在血清EsxA特异性IgG抗体水平存在显著差异(p<0.05)。IgG1、IgG2抗体水平也有差异,两者具有统计学意义(p<0.05)。小鼠感染后血清EsxA特异性IgG,IgG1,IgG2a OD值分别为(0.530±0.029),(0.1602±0.125),(0.314±0.117)。IgG,IgG2a水平存在显著差异。脾细胞培养上清细胞因子IFN-γ、IL-4显著升高,IFN-γ水平升高更明显。  结论:  成功构建了Es xA的原核表达系统,表达、纯化了重组Es xA蛋白,金葡菌感染病人血清EsxA特异性IgG,IgG1,IgG2水平显著升高,以IgG1占优势。Es xA刺激金葡感染小鼠脾细胞IFN-γ,IL-4显著升高,以IFN-γ为甚,表明EsxA可诱导感染小鼠Th1优势的细胞免疫。
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